Экстракорпоральное поджелудочной железы Organogenesis от дисперсных мышиных эмбриональных прародителей

Трехмерная способ культивирования описано в данном протоколе повторяет развитие поджелудочной железы от дисперсных эмбриональных клеток-предшественников мышь поджелудочной железы, включая их существенного расширения, дифференцировки и морфогенеза в разветвленной органа. Этот метод поддается визуализации, функциональной вмешательства и манипуляции нише.

Общая цель этой процедуры заключается в расширении ассоциированных мультипотентных предшественников поджелудочной железы в 3D-каркасе Матригеля, где они могут дифференцироваться и самоорганизовываться. Это достигается путем выделения поджелудочной железы из эмбрионов мышей на 10,5-й день. Вторым шагом является удаление мезенхимы и диссоциация эпителия на отдельные клетки и небольшие комочки.

Заключительным этапом является суспензия клеток в матригеле и инкубация полимеризованного геля для расширения. В конечном счете, это приводит к самоорганизующимся разветвленным органоидам поджелудочной железы, подобным эмбриональной поджелудочной железе мыши, которые могут быть визуализированы вживую или в конечной точке с помощью микроскопии. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, как и всеми другими методами лечения поджелудочной железы, заключается в том, что мы начинаем с четко определенной и менее сложной клеточной популяции.

Предшественники поджелудочной железы лучше поддерживаются в 3D, чем в 2D-культурах клеток. Этот метод может помочь нам ответить на некоторые важные вопросы в этой области, такие как взаимодействие клеток или взаимодействие клеток с матриксом. В конечном итоге это приведет к пониманию того, как возникает поляризация, а следовательно, и как возникает клеточное разнообразие.

Применение этого метода распространяется и на терапию диабета после адаптации у человека, потому что мы можем расширить поджелудочную железу, что даст начало лучшим клеткам, вырабатывающим инсулин. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этап удаления за удивительное время трудно выполнить, а этап диссоциации важен для формирования органоидов органов. Для начала поместите эмбрион мыши, который был ранее выделен на 10,5-й день эмбриона, в чистую 35-миллиметровую чашку Петри в PBS.

Далее с помощью тонких щипцов шириной примерно 0,05 миллиметра удалите переднюю конечность. Аккуратно вставьте щипцы в отверстие, чтобы отделить пищеварительный тракт от области спинного мозга. Найдите желудок, печень и кишечник на эмбрионе.

Затем с помощью игл изолируют желудочно-кишечный тракт от желудка до кишечника. Поместите желудочно-кишечный тракт в холодный ДММ на лед. Повторите предыдущий шаг, чтобы изолировать каждый отдельный желудочно-кишечный тракт.

Держите отдельные желудочно-кишечные тракты в разных колодцах. В планшете на 24 лунки с холодным ДММ на льду их необходимо держать отдельно только в том случае, если генотип имеет значение. Поместите один желудочно-кишечный тракт в чистую 33-миллиметровую чашку Петри в холодный PBS и визуализируйте на микроскопе вскрытия, используя освещение снизу в виде светлого поля.

Как только желудочно-кишечный тракт будет в фокусе, рассеките заднюю часть почки поджелудочной железы с помощью электролитических заточенных языков, а затем игл или игл шприца 20-го калибра. Изолируйте почку поджелудочной железы с как можно меньшим количеством мезенхимы вокруг эпителия. Поместите изолированный бутон в чашку Петри и выдержите в холодном растворе один пункт 25 миллиграмм на миллилитр в течение двух-трех минут.

С этого момента при переносе бутона используйте пламя из стеклянного капилляра объемом 50 микролитров, прикрепленного к горлу управляемой гибкой трубкой. Поместите бутон в раствор под микроскопическим контролем. Поместите почку поджелудочной железы обратно в PBS.

Затем очистите изолированную почку поджелудочной железы от мезенхимы с помощью иглы и мягкой аспирации со стеклянным капилляром. Как только вся мезенхима будет удалена, промойте почку поджелудочной железы в холодном PBS и перенесите каждую почку в отдельные лунки. В 60-луночной пластине, содержащей 10 микролитров холодного цифрового мультиметра на лунку.

Чтобы промыть рассеченные почки поджелудочной железы, пипеткой поместите каждую почку в отдельные конические лунки и мини-лоток на 60 лунок, содержащий 10 микролитров PBS на каждую. Ну, затем перенесите почку поджелудочной железы в лунку, содержащую 10 микролитров 0,05% трипсина, и инкубируйте в течение четырех минут. При температуре 37 градусов Цельсия инактивировать трипсин, перенеся бутон в лунку, содержащую 10 микролитров ДММ с 10% сывороткой плода теленка. Пропустите клеточную суспензию через тонкий капилляр, протянутый с помощью пипетки, чтобы диссоциировать клетки.

Частичная диссоциация рекомендуется, потому что органоиды поджелудочной железы оптимально начинают из небольших групп от 5 до 15 клеток. Объедините клетки нескольких эмбрионов в эйнорскую трубку, чтобы свести к минимуму различия, возникающие в результате индивидуальной обработки. Развести клеточную суспензию в соотношении один к трем в охлажденном матригеле.

Аликвотируйте разведенную клеточную суспензию в четырехлуночный планшет или 96-луночный планшет с помощью пипетирования. Восемь микролитров на лунку. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы гель matri загустел.

Заполните микролунку питательной средой и поместите пластину во увлажненную среду при температуре 37 градусов Цельсия, содержащую 5% CO2 и 95% воздуха. Заменяйте среду каждый четвертый день и ежедневно следите за растущими колониями поджелудочной железы. Задокументируйте процесс роста с помощью покадровой микроскопии, дорсальных клеток-предшественников поджелудочной железы мышей в эмбриональном возрасте.

На 10,5-й день, выращенный в органоидной среде, наблюдалось расширение клеточных кластеров в течение семидневного периода культивирования и начало ветвиться через четыре дня. Одиночные клетки не расширялись и теряли экспрессию PDX one. В то время как большие кластеры сохранили pdx.

Одно выражение, клетки-предшественники поджелудочной железы выращены в сфере. Среда расширяется чаще, чем в органоиде. Кроме того, Illumina была обнаружена на второй-третий день, и дальнейшее расширение привело к образованию однослойных полых сфер с редкими локальными многослойными областями.

Гистологический анализ семидневного органоида подтвердил состав предшественников поджелудочной железы, о чем свидетельствует положительное окрашивание на H, NF, один, В и PDX один: дифференцированные клетки также были идентифицированы путем окрашивания на экзокринный маркер амилазу и эндокринный маркер инсулин. Сферы выражены более однородно. Маркеры предшественников поджелудочной железы hnf one B и PDX one и дифференцируются меньше, чем органоиды.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что после этой процедуры нельзя полностью диссоциировать клетки. Вы можете относиться к этим органоидам так же, как к маленькому органу. Таким образом, вы можете выполнить обычный QPCR.

Вы можете выполнять одиночную камерную ПЦР, делать визуализацию в реальном времени. Вы можете заниматься иммуногистохимией, и, используя все эти методы, вы можете получить представление о клеточной динамике, происходящей в этой маленькой органоподобной структуре, вы можете инкубировать с маленькими химическими веществами и, следовательно, взаимодействовать с различными путями, представляющими интерес. Этот метод проложит путь исследователям к выявлению механизмов развития поджелудочной железы и лучшего формирования клеток в настоящее время у мышей, а в будущем, начиная с человеческих eESL или IP S клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сделать маленькую поджелудочную железу, которая имитирует нормальное развитие поджелудочной железы у нескольких прародителей в 3D культурной среде.