Поверхности клеток Маркер опосредованной Очистка плюрипотентных клеточных промежуточных от модели Перепрограммируемая Mouse

Общая цель данной процедуры заключается в выделении редких интермедиатов репрограммирования из культур репрограммируемых эмбриональных фибробластов мыши. Это достигается путем первоначального получения эмбриональных фибробластов мыши из эмбрионов E 13.5 мышей репрограммируемой линии. На втором этапе эмбриональные фибробласты мыши с низким числом пассажей высевают в среду для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), дополненную доксициклином для запуска процесса репрограммирования.

Затем клетки собирают в выбранные временные точки в процессе репрограммирования и маркируют антителами к специфическим маркерам клеточной поверхности. В конечном итоге редкие промежуточные формы репрограммирования могут быть изолированы методом FACS для дальнейшего экспериментального анализа. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами является возможность проведения механистических исследований редких промежуточных форм репрограммирования в отсутствие клеток, устойчивых к процессу репрограммирования, которые составляют основную часть популяции. Чтобы получить эмбриональные фибробласты мыши или мезенхимальные клетки, начните с переноса рога матки эмбрионального дня 13.5 в чашку для культивирования тканей диаметром 10 см, содержащую 10 мл стерильного PBS.

Затем с помощью стерильных хирургических ножниц разрежьте рог на отдельные фрагменты, в каждом из которых находится один эмбрион. Далее, используя диссекционный микроскоп в ламинарном шкафу для работы с культурами тканей, с помощью стерильного пинцета осторожно удалите оболочку матки и внезародышевую мембрану, окружающую каждый эмбрион, и перенесите каждый очищенный эмбрион в отдельные чашки диаметром 10 сантиметров, содержащие 10 миллилитров свежего PBS. Затем с помощью пинцета удалите у каждого эмбриона голову, конечности, хвост и внутренние органы.

Заморозьте головы в индивидуальных пробирках объемом 1.5 milliliter для последующего генотипирования по мере необходимости. Перенесите каждое туловище в новые индивидуальные чашки диаметром 10 centimeter и с помощью двух хирургических лезвий измельчайте каждый эмбрион в течение двух минут. Проведите переваривание кусочков ткани в 200 microliters трипсина ЭДТА в течение трех-пяти минут при комнатной температуре, после чего повторно измельчайте ткань в течение двух минут.

Затем инактивируйте трипсин двумя миллилитрами среды meth и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки на 1000 µL. Продолжите механическую диссоциацию ткани путем осторожного пипетирования, после чего перенесите клеточный раствор в 10-сантиметровую чашку, покрытую желатином. Добавьте в культуру еще 10 мл среды meth.

Через 24–48 часов планшет должен быть плотно покрыт МЭФ. Чтобы перепрограммировать МЭФ, сначала разморозьте замороженную культуру МЭФ с низким числом пассажей в водяной бане при 37 °C, а затем перенесите содержимое в пробирку, содержащую 10 мл предварительно нагретой среды для МЭФ. После центрифугирования клеток ресуспендируйте осадок в 12 мл свежей среды для МЭФ и перенесите клеточную суспензию в культуральный флакон T 75, покрытый желатином. После периода восстановления продолжительностью 24–48 часов промойте МЭФ раствором PBS, а затем отделите клетки, добавив три мл трипсина-ЭДТА на три–пять минут при 37 °C.

Затем остановите ферментативное расщепление, добавив пять миллилитров среды для MET, и проведите дальнейшую диссоциацию клеток путем осторожного перемешивания с помощью 10-миллилитровой пипетки. Далее проведите репрограммирование MET-клеток, высеяв их в новые флаконы T 75, покрытые желатином, с плотностью 6.7 × 10³ клеток на квадратный сантиметр в 12 миллилитрах среды для IPSC, содержащей два микрограмма на миллилитр доксициклина, в течение первых шести дней. Заменяйте среду каждые два дня на свежую среду для IPSC с добавлением доксициклина; сбор промежуточных стадий репрограммирования осуществляйте в требуемые моменты времени путем отсоединения с помощью трипсина-ЭДТА, как было продемонстрировано ранее для каждой полученной суспензии промежуточных стадий.

Промойте клетки в PBS. Затем ресуспензируйте осадок в среде FACS для мечения антителами, чтобы выделить полностью репрограммированные культуры ИПСК.

Культивируйте клетки в среде для IPSC без доксициклина еще от четырех до семи дней для маркировки репрограммированных клеток. Маркируйте собранные промежуточные формы соответствующими интересующими антителами. Через 10 минут осторожно постучите по пробиркам для ресуспендирования клеток, а затем поместите пробирки на лед еще на 10 минут.

После второй инкубации промойте клетки в 10 миллилитрах холодного PBS на пробирку. Затем осторожно аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадки в соответствующем объеме среды для маркировки, дополненной strippin P размера семь, на льду. Через 20 минут промойте клетки в еще 10 мл холодного PBS и ресуспендируйте клеточные осадки в среде для маркировки, дополненной пропидиййодидом.

Отфильтруйте любые скопления клеток, пропустив суспензию через сито с размером пор 70 micrometer, а затем перенесите клетки в соответствующие пробирки для проточной цитометрии на льду. Для контролей компенсации ресуспендируйте криопробирку с клетками IPS, поддерживаемыми на облученных mes, в 800 microliters маркировочного буфера.

Отберите 200 µL клеток для немаркированного контроля. Затем распределите оставшуюся клеточную суспензию между тремя пробирками объемом 15 мл для одноцветных контролей и промаркируйте образцы, как было продемонстрировано ранее, чтобы проанализировать промежуточные продукты с помощью проточной цитометрии. Начните с установки гейта на графике прямого и бокового светорассеяния для исключения клеточного дебриса.

Затем используйте соотношение высоты прямого светорассеяния (forward scatter height) к площади прямого светорассеяния (forward scatter area) для исключения агрегатов, а также канал PI относительно прямого светорассеяния для выделения гейтом живых PI-отрицательных клеток. Используйте немаркированные клетки для настройки напряжения в каналах Pacific blue, FITC и PSI seven.

Желательно расположить популяцию клеток в нижней части соответствующего канала. Затем с помощью немаркированных контрольных клеток установите гейты, чтобы разделить культуры репрограммирования по третьему, шестому и девятому дням на следующие популяции: клетки SSEA1-отрицательные TH1.2-положительные, клетки SSEA1-отрицательные TH1.2-отрицательные и промежуточные формы репрограммирования SSEA1-положительные TH1.2-отрицательные.

Затем далее разделите фракцию клеток девятого дня, положительную по SSEA 1 и отрицательную по TH 1.2, используя график SSEA 1 по отношению к EPAM. Используя немаркированный контроль, установите гейты вокруг EPAM-положительных и EPAM-отрицательных клеток, как показано здесь. В завершение соберите клетки в 1–2 мл среды для культивирования IPS-клеток.

После индукции доксициклином репрограммируемые миты претерпевают отчетливые морфологические изменения примерно к шестому дню. Начинают появляться ранние колониеподобные участки, размер которых продолжает увеличиваться при дальнейшем культивировании. Результатом успешного эксперимента по репрограммированию будет появление более 500 колоний на флакон T 75, в который изначально было посеяно 5 × 10⁵ клеток; при этом у сформированных культур IPS будут наблюдаться характерные куполообразные колонии, в которых практически отсутствуют дифференцированные клетки.

Морфологические и молекулярные изменения в процессе репрограммирования отражаются в изменении экспрессии на поверхности клеток TRA-1-2, SSEA-1 и, в конечном итоге, Oct4. В то время как МЭСК преимущественно положительны по TRA-1-2 и отрицательны по другим маркерам, к третьему дню большая часть клеток начинает снижать экспрессию TRA-1-2, и очень малая группа становится положительной по SSEA-1. Фактически, промежуточное состояние репрограммирования для данного временного интервала на шестой и девятый дни характеризуется увеличением процента SSEA-1-положительных клеток, который к двенадцатому дню обычно значительно превышает 10%.

Может быть обнаружена подгруппа SSEA-1-положительных клеток, которые также являются положительными по epca. Установленные истинные культуры ИПСК будут иметь сильную положительную реакцию.

Для SSEA-1 и EPCA при выполнении данной процедуры важно помнить, что следует использовать только мапы с низким числом пассажей, которые были предварительно надлежащим образом генотипированы.