Поверхности клеток Маркер опосредованной Очистка плюрипотентных клеточных промежуточных от модели Перепрограммируемая Mouse

Общая цель этой процедуры заключается в выделении редких перепрограммируемых промежуточных продуктов из культур перепрограммированных эмбриональных фибробластов мыши. Это достигается путем получения эмбриональных фибробластов мыши из эмбрионов E 13.5 перепрограммируемой линии мышей. На втором этапе эмбриональные фибробласты мыши, расположенные с низким проходом, засеиваются в индуцированные плюрипотентные стволовые или IPS-клеточные среды с добавлением доксициклина для инициирования процесса перепрограммирования.

Затем клетки собирают в выбранные моменты времени во время перепрограммирования и помечают антителами против определенных маркеров клеточной поверхности. В конечном счете, редкие перепрограммированные промежуточные продукты могут быть выделены по фактам для дальнейшего экспериментального анализа. Основное преимущество данной методики из существующих методов состоит в том, что механистические исследования могут быть выполнены на редких перепрограммирующих промежуточных продуктах при отсутствии рефрактерных к процессу перепрограммирования клеток, которые составляют основную массу популяции. Для получения эмбриона, фибробластов или mes мыши начинают с переноса эмбрионального рожка матки на 13,5-й день в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 10 миллилитров стерильных PBS.

Затем с помощью стерилизованных ножниц хирургического класса разрежьте рог на отдельные части, каждая из которых содержит один эмбрион. Затем под диссекционным микроскопом в вытяжке для культуры тканей с помощью стерилизованных щипцов осторожно удалите маточную оболочку и дополнительную эмбриональную оболочку, окружающую каждый эмбрион, и переложите каждый оголенный эмбрион в индивидуальные 10-сантиметровые чашки с 10 миллилитрами свежего PBS. Затем удалите голову, конечности, хвост и внутренние органы каждого эмбриона с помощью щипцов.

При необходимости заморозьте головки в отдельных пробирках объемом 1,5 миллилитра для генотипирования. Переложите каждое туловище в новые индивидуальные 10-сантиметровые пластины и с помощью двух хирургических лезвий измельчите каждый эмбрион в течение двух минут. Расщепите кусочки ткани в 200 микролитрах трипсина ЭДТА в течение трех-пяти минут при комнатной температуре, после чего дополнительно две минуты измельчите.

Затем инактивируйте триин двумя миллилитрами метамфетаминовой среды и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку с помощью пипетки объемом 1000 микролитров. Далее механически диссоциируйте ткань с помощью щадящего пипетирования, а затем перенесите клеточный раствор в покрытую желатином 10-сантиметровую чашку. Добавьте в культуру дополнительно 10 миллилитров метамфетаминовой среды.

Через 24-48 часов пластину следует плотно покрыть MEF, чтобы перепрограммировать MEF, сначала разморозить замороженную культуру метамфетамина с низким проходом на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, а затем перенести содержимое в пробирку, содержащую 10 миллилитров предварительно подогретой метамфетаминовой среды. После вращения клеток повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах свежей метамфетаминовой среды и перенесите клеточную суспензию в сосуд для культуры T 75, покрытый желатином. После периода восстановления от 24 до 48 часов промойте MEF с помощью PBS, а затем отделите клетки тремя миллилитрами трипсина ЭДТА на три-пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем остановите ферментативное расщепление пятью миллилитрами метамфетаминовой среды и далее диссоциируйте клетки путем бережного перемешивания с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. Затем перепрограммируйте меты, засев клетки на новый желатин, покрытые колбами Т-75 в соотношении 6,7 умножить на 10 до трети клеток на квадратный сантиметр в 12 миллилитрах среды IPSC, содержащей два микрограмма на миллилитр доксициклина в течение первых шести дней. Заменяйте среду через день свежим доксициклином с добавлением IPSE, собирая промежуточные продукты в требуемые моменты времени с помощью отделения трипсина ЭДТА, как только что было продемонстрировано для каждой собранной промежуточной суспензии.

Промойте клетки в PBS. Затем ресус. Суспендируйте гранулы в факсимильном носителе для мечения антителами, чтобы получить полностью перепрограммированные культуры IPSC.

Выращивайте клетки в среде IPSC, не содержащей доксициклина, в течение следующих четырех-семи дней, чтобы пометить перепрограммированные клетки. Пометьте собранные промежуточные продукты соответствующими антителами, представляющими интерес. Через 10 минут осторожно постучите по трубкам, чтобы снова суспендировать клетки, а затем поместите трубки на лед еще на 10 минут.

После второй инкубации промойте клетки в 10 миллилитрах холодного PBS на пробирку. Затем осторожно аспирируют надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулы в соответствующем объеме маркировочной среды, дополненной стриппином Р размера семь на льду. Через 20 минут промойте клетки еще в 10 холодных PBS и повторно суспендируйте клеточные гранулы в маркировочных средах с добавлением йодида пропидия.

Отфильтруйте любые клеточные комки, пропустив суспензию через ситечко 70 микрометров, а затем перенесите клетки в соответствующие факсимильные трубки на льду. Для управления компенсацией. Резус суспендирует криопробирку IPS-клеток, содержащуюся на облученных MES в 800 микролитрах меченого буфера.

Выделяем 200 микролитров ячеек для неразмеченного контрольного элемента. Затем разделите оставшуюся клеточную суспензию между тремя 15-миллилитровыми пробирками для контроля одного цвета и пометьте образцы как только что продемонстрированные для анализа промежуточных продуктов с помощью проточной цитометрии. Начните с установки ворот на диаграмме рассеяния впереди стороной, чтобы исключить мусор.

Затем используйте высоту прямого рассеяния относительно области прямого рассеивания, чтобы исключить агрегаты и канал PI против прямого рассеивания. К воротам на PI отрицательные живые клетки. Используйте немаркированные элементы для регулировки напряжения для семи каналов Pacific Blue FITC и PSI.

Идеальное расположение популяции клеток на нижнем конце соответствующего канала. Затем установите вентили с непомеченными контрольными клетками, чтобы подразделить перепрограммируемые культуры на третий, шестой и девятый дни. Популяции SSEA: одна отрицательная TH, 1,2-положительная клетка, SSEA, одна отрицательная, TH, 1,2-отрицательные клетки и перепрограммируемые промежуточные клетки: SSEA, одна положительная, TH, 1,2-отрицательные клетки.

Затем далее разделите день девятый, SSEA один положительный TH 1,2 отрицательную дробь с графиком SSEA one против EPAM. С помощью немеченого элемента управления нарисуйте вентили вокруг положительных и отрицательных клеток EPAM, как показано здесь. Наконец, соберите клетки в один-два миллилитра клеточной среды IPS.

После индукции доксициклина мифы о перепрограммировании претерпевают отчетливые морфологические изменения примерно на шестой день. Начинают появляться ранние участки, похожие на колонии, которые продолжают увеличиваться в размерах при дальнейшей культуре. Хороший эксперимент по перепрограммированию приведет к тому, что на Т будет приходиться более 500 колоний на 75, первоначально засеянных пятью умножить на 10 до пятой клетки, а созданные культуры IPS будут обладать характерными куполообразными колониями и будут в основном лишены дифференцированных клеток.

Морфологические и молекулярные изменения при перепрограммировании отражаются в изменениях экспрессии на поверхности клетки бедра 1.2 SSEA one, и в конечном итоге epca. В то время как MES преимущественно положительны для бедра 1.2 и отрицательны для других маркеров, к третьему дню большая часть клеток начала снижать экспрессию бедра 1.2, и очень небольшая подгруппа стала положительной для SSEA one. Фактическое перепрограммирование, промежуточное для этой временной точки на шестой и девятый дни, повышенный процент положительных клеток SSEA one, обычно значительно превышающий 10%, может быть обнаружен примерно к 12-му дню.

Может быть обнаружено подмножество положительных клеток SSEA one, которые также являются положительными. Для epca. Установленные культуры клеток IPS будут сильно положительными.

Для SSEA one и EPCA При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что следует использовать только карты низких проходов, которые были предварительно правильно генотипированы.