Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы индуцировать высокоэффективную дифференцировку дофаминергических нейронов. В пробирке. Это достигается путем предварительного получения одноклеточной адгезионной культуры из плюрипотентных стволовых клеток человека P.

На втором этапе среда для клеточных культур переключается на среду для индукции нейронов для индукции предшественников напольных пластин. Затем дофаминергические нейроны культивируются в средах созревания. И, наконец, одноклеточные предшественники дофаминергических нейронов культивируются на поли-L-орнитиновых пластинах ламината фибронектина и средах созревания в течение 30 дней.

В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия может быть использована для оценки экспрессии важных маркеров дофаминергических нейронов. Данная методика имеет большее преимущество перед существующей нейросферой по нейрокислотному протоколу. Он может генерировать более однородную двойную нейронную популяцию с более высокой эффективностью.

Через четыре дня после пассажа отсасывайте среду из клеточных культур. Отделите клетки одним миллилитром Аккутана на лунку и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Во время инкубации добавьте по одному миллилитру желатина в каждую лунку шестилуночной пластины, а затем поместите пластину вместе со свежеприготовленными пластинами, покрытыми гелевым покрытием матри, в инкубатор

Когда клетки станут полуплавающими, проведите их пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы получить суспензию за одну клетку. Затем вытащите клетки в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте их в течение трех минут. При 258 G и комнатной температуре повторно суспендировать гранулу в соответствующем количестве питательной среды для культуры плюрипотентных стволовых клеток человека с добавлением сыворотки и добавить тививин до конечной концентрации в два миллимоляра.

Затем инкубируйте клетки в пластинах, покрытых желатиновой оболочкой, в соотношении один к одному при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Чтобы удалить метамфетамин, подайте его, затем перенесите клетки в новую 15-миллилитровую трубку. Разведите их в среде плюрипотентных стволовых клеток человека, дополненной сывороткой, и подсчитайте их после повторного вращения клеток, повторно суспендируйте клетки в MT.SR одной среде с тиасом Иваном до концентрации 180 000 клеток на миллилитр.

Затем отсасывайте матригель из покрытых пластин и выдавайте по два миллилитра клеток на лунку. 48 часов. После перекладки ячеек в матригеловые пластины.

Отсадите среду из каждой лунки и промойте клетки один раз PBS. Затем добавьте два миллилитра KSR для дифференцировки, среду с добавлением SB 4 31, 50 42 и L DN 1 9 3 1 8 9 в клетки, меняя среду каждый день с D нуля до D 20, как показано на графике на 20 день, аспирируйте среду для дифференцировки и отделите клетки одним миллилитром 37 градусов Цельсия в лунке при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут. Во время инкубации прогрейте поли Л орин ламинин фибронектиновыми пластинами в инкубаторе.

Затем после Резуса, суспендируя отделенные клетки в одноклеточную суспензию, разбавляют клетки в нейробазальной среде. После подсчета раскрутите клетки вниз и повторно суспендируйте гранулу в В 27, среде для дифференцировки в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Затем отсасывайте фибронектин из полиола орина ламинина с фибронектиновыми пластинами.

Промойте их дважды PBS и перенесите в каждую по 400 микролитров клеток. Ну и окончательно меняйте среду после первых 24 часов, а затем через день до экспериментальной конечной точки для удаления любых неприкрепленных мертвых клеток. Как показано на этих изображениях, репламентированные одноклеточные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека будут расширяться в виде кластеров в течение первых 48 часов дифференцировки, достигая около 70% конфлюенции.

После дифференцировки клетки достигают полного слияния всего за три-четыре дня. К 20-му дню дифференцированные клетки прикрепляются и растут в виде небольших скоплений. В течение следующих пяти дней в скоплениях появляются гораздо более интенсивные и морфологически неповрежденные аксоны и невриты, образующие некоторые связи между скоплениями.

После 11 дней дифференцировки плюрипотентные стволовые клетки человека могут быть эффективно преобразованы в предшественники напольных пластин. Как показано на этих изображениях, почти все клетки экспрессируют предшественник напольной пластины, клеточные маркеры гнездятся в А и более двух и более. 90% клеток экспрессируют Corin O OTX two и LM X 1 A. После дальнейшей дифференцировки клетки-предшественники напольных пластин специализируются на дофаминергических нейронах, экспрессирующих TUJ one и TH. Эти дофаминергические нейроны имеют идентичность девяти, поскольку они экспрессируют GK два и имеют отрицательный результат на кальбиндин Эксперименты по иммуноокрашиванию также показывают, что нет астроцитов GFAP и очень мало ГАМКергических нейронов, что указывает на то, что дифференцировка специфична исключительно для линии дофаминергических нейронов.

При тестировании этой процедуры важно сохранять постоянство в повседневной клеточной культуре и убедиться, что среда свежеприготовлена с правильными ингредиентами.