Режиссер дофаминергических Neuron Дифференциация от человека плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в индукции высокоэффективной дифференцировки дофаминергических нейронов in vitro. Для этого сначала подготавливают культуру адгезивных единичных клеток человеческих плюрипотентных стволовых клеток.

На втором этапе среду для культивирования клеток заменяют на среду для индукции нейронов с целью получения предшественников вентральной части мозгового желудочка (floorplate progenitors). Затем дофаминергические нейроны культивируют в среде для созревания. В завершение одиночные предшественники дофаминергических нейронов культивируют в течение 30 дней в среде для созревания на планшетах, покрытых поли-L-орнитином и фибронектином.

В конечном итоге, иммунофлуоресцентная микроскопия может быть использована для оценки экспрессии важных маркеров дофаминергических нейронов. Данный метод обладает значительным преимуществом по сравнению с существующим протоколом получения нейросфер на нейроацидной основе. Он позволяет с большей эффективностью получать более гомогенную популяцию двойных нейронов.

Через четыре дня после пассажа аспирируйте среду из клеточных культур. Отделите клетки, добавив в каждую лунку один миллилитр Accutane, и инкубируйте их при 37 °C в течение пяти минут. Во время инкубации добавьте по одному миллилитру желатина в каждую лунку шестилуночного планшета, после чего поместите этот планшет вместе с недавно подготовленными планшетами, покрытыми Matrigel, в инкубатор.

Когда клетки станут частично открепленными (полуплавающими), несколько раз пропипетируйте их вверх-вниз для получения суспензии одиночных клеток. Затем перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение трех минут. При 258 Gs и комнатной температуре ресуспендируйте осадок в соответствующем объеме среды для культивирования человеческих плюрипотентных стволовых клеток с добавлением сыворотки и добавьте thivivin до конечной концентрации 2 мМ.

Затем инкубируйте клетки в планшетах с желатиновым покрытием в соотношении один к одному при 37 °C в течение 30 минут. Для удаления фидерных клеток MEF перенесите клетки в новую пробирку объемом 15 мл. Разведите их в среде для человеческих плюрипотентных стволовых клеток с добавлением сыворотки и подсчитайте их количество после повторного центрифугирования, затем ресуспендируйте клетки в среде MT.SR one с добавлением thias Ivan до концентрации 180 000 клеток на мл.

Затем аспирируйте Matrigel из покрытых планшетов и внесите по два миллилитра суспензии клеток в каждую лунку. Инкубируйте в течение 48 часов после перепосева клеток в планшеты с Matrigel.

Отоصبите среду из каждой лунки и один раз промойте клетки раствором PBS. Затем добавьте к клеткам два миллилитра дифференцировочной среды KSR, дополненной SB 4 31, 50 42 и L DN 1 9 3 1 8 9, меняя среду ежедневно с 0-го по 20-й день, как указано в таблице. На 20-й день отоصبите дифференцировочную среду и отделите клетки, добавив в каждую лунку один миллилитр acutus при 37 °C на пять минут. Во время инкубации прогрейте в инкубаторе планшеты с поли-L-лизином, ламинином или фибронектином.

Затем после ресуспендирования, переведя отделенные клетки в суспензию из одиночных клеток, разведите их в нейробазальной среде. После подсчета центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в дифференцировочной среде B 27 с концентрацией 1 миллион клеток на миллилитр. Затем аспирируйте фибронектин с планшетов с поли-L-орнитином, ламинином и фибронектином.

Промойте их дважды раствором PBS и перенесите по 400 µL клеток в каждую лунку. В завершение замените среду через первые 24 часа, а затем каждые два дня до конечной точки эксперимента, чтобы удалить все неприкрепившиеся погибшие клетки. Как показано на этих изображениях, пересеянные монослойные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека будут расти в виде кластеров в течение первых 48 часов дифференцировки, достигая примерно 70% конфлюэнтности.

После дифференцировки клетки достигают полной конфлюэнтности всего за три-четыре дня. К 20-му дню дифференцированные клетки прикрепляются и растут в виде небольших кластеров. В течение следующих пяти дней внутри кластеров появляются гораздо более интенсивные и морфологически сохранные аксоны и нейриты, формируя связи между кластерами.

После 11 дней дифференцировки человеческие плюрипотентные стволовые клетки могут быть эффективно преобразованы в предшественники ромбовидной пластинки. Как показано на этих изображениях, почти все клетки экспрессируют маркеры предшественников ромбовидной пластинки nest in и fox A two, и более 90% клеток экспрессируют Corin O OTX two и LM X one A. После дальнейшей дифференцировки клетки-предшественники ромбовидной пластинки специализируются в дофаминергические нейроны, которые экспрессируют TUJ one и TH. Эти дофаминергические нейроны имеют идентичность A9, так как они экспрессируют GK two и отрицательны по кальбиндину. Эксперименты по иммуноокрашиванию также демонстрируют отсутствие астроцитов GFAP и очень малое количество ГАМК-ергических нейронов, что указывает на то, что дифференцировка специфична исключительно для линии дофаминергических нейронов.

При тестировании данной методики важно соблюдать единообразие в повседневном культивировании клеток и убедиться, что среда приготовлена свежая и содержит правильный набор компонентов.