Иммунофлуоресцентное метод характеристики пищевода клеток Барретта

Общая цель данного эксперимента заключается в оценке влияния медикаментозного лечения на клеточную структуру и локализацию белков в клетках ПБ. Это достигается путем инкубации выращенных на стекло покровных стекол клеток с выбранным препаратом в стандартных условиях клеточной культуры. В качестве второго этапа инкубируют обработанные клетки с фиксатором, который сохраняет структуру белка и локализацию.

Затем неподвижные клетки инкубируют последовательно с первичными и флуоресцентно меченными вторичными антителами с целью визуализации изменений в выбранном белке-мишени с помощью флуоресцентной микроскопии, которые показывают, как медикаментозное лечение клеток be, изменяет локализацию белка и клеточную структуру на основе визуализации иммунофлуоресцентного окрашивания. Хотя этот метод может дать представление о пищеводе Барретта, он также может быть применен к другим системам, включая рак и нормальные клетки. Начните эту процедуру с помещения 18-миллиметровых крышек стекла в стеклянную чашку Петри и автоклавируйте их.

Затем переложите крышку автоклава на 12-луночную чашку для культуры тканей с помощью стерильной стеклянной пипетки, прикрепленной к вакуумной трубке. После этой стирки чехол сползает со стерильным PBS и фильтрующим материалом. Далее трипсин.

Иммортализированные клетки подсчитывают клетки с помощью автоматического клеточного счетчика или гемоцитометра, затем разбавляют клетки в питательных средах до концентрации от 20 000 до 40 000 клеток на миллилитр. Затем поместите по одному миллилитру клеток в каждую лунку, содержащую покровную пластинку. При общем количестве клеток от 20 000 до 40 000 клеток в лунке используйте стерильный наконечник для дозатора, чтобы аккуратно протолкнуть крышку на дно лунки, чтобы убедиться, что клетки прикрепляются к крышке.

Для обработки клеток ПБ необходимо развести выбранный препарат в среде 37 градусов Цельсия до нужной концентрации, хорошо перемешать, многократно перевернув пробирку или используя вихревой смеситель. Начните лечение через 24 часа после первоначального размещения клеток ПБ, чтобы обеспечить прикрепление клеток к покрытию Теперь предварительно маркированные лекарственные препараты и обработанные лабораторной ручкой образцы обработаны транспортным средством, чтобы различать сравнение и контроль. Дополнительный покровный листок клеток обработайте 0,1%-ным носителем, разведенным в питательных средах.

После этого поместите клетки в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и влажности 98%. Теперь по истечении нужного времени инкубации препарата обработайте его аспирацией и быстро промойте покровные стекла одним XPBS при комнатной температуре. Затем аспирируйте PBS и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру PBS, содержащему 4% PFA, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем аспирируйте 4% P-F-A-P-B-S Промойте крышку три раза по пять минут каждый раз PBS при комнатной температуре. Храните крышки в течение одной недели в PBS и 0,1% PFA при температуре четыре градуса Цельсия, если это необходимо. Для проницаемости глаз неподвижных клеток PFA для того, чтобы позволить антителу получить доступ к внутриклеточным мишеням, инкубируют клетки с 50 миллимолярными хлоридами аммония, разведенными в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем постирайте их при комнатной температуре PBS один раз в течение пяти минут. Это позволит снизить фон для предотвращения неспецифического связывания антител с клеточными белками. Инкубируйте клетки ПБ в течение 30 минут в 100-300 микролитрах PBS, содержащих 0,1% тропонина и 0,5% BSA.

Затем приготовьте квадратную форму для биопробы, накрыв дно камеры слоями влажными бумажными полотенцами и положив сверху слой отдушки. Отметьте парфюм лабораторной ручкой, чтобы определить покровные листы. Аккуратно перенесите чехол ячейками вверх на параметр, используя щипцы и иглу шприца.

Теперь разведите первичное антитело в PBS, содержащем 0,5% БСА и 0,1% сапонина, аккуратно промокните блокирующий раствор. Используя лабораторную ткань, добавьте 100 микролитров раствора первичного антитела и инкубируйте клетки BE в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день.

Промойте предметные стекла три раза PBS, содержащим 0,5% BSA и 0,1% тропонина, в течение пяти минут каждый раз при комнатной температуре. Затем разбавляют вторичное антитело, конъюгированное с флуоресцентной меткой, в PBS, содержащем 0,5% БСА и 0,1% понента. Добавьте по 100 микролитров разведенного антитела в каждую покровную листовку и инкубируйте клетки в течение двух часов при комнатной температуре. Через два часа добавьте 100 микролитров разведенного антитела.

Стирайте крышки три раза по пять минут каждый раз в PBS, содержащем 0,5% BSA и 0,1% тропонина. Снимите буфер для стирки и добавьте от 100 до 300 микролитров PBS в покровные стекла. Аккуратно поднимите чехол с помощью щипцов и промокните PBS лабораторной салфеткой или бумажным полотенцем.

Затем добавьте 15 микролитров подходящего монтажного носителя Antifa, содержащего DPI, в защитное стекло. Поместите перевернутую крышку на предметное стекло микроскопа ячейками вниз. Затем поместите слайды в папку для слайдов и держите их вдали от прямых солнечных лучей в течение ночи при комнатной температуре, чтобы среда Antifa затвердела.

После того, как среда Antifa застынет, предметные стекла могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия или минус 20 градусов Цельсия до микроскопической визуализации. На этом этапе снимите предметные стекла для хранения с отрицательных 20 градусов Цельсия или четырех градусов Цельсия и дайте им нагреться до комнатной температуры. Включите микроскоп и ртутную дуговую лампу.

Поместите предметное стекло микроскопа со скользящей крышкой к объективу на предметный столик микроскопа. Далее выбираем фильтр DAPI и открываем затвор. Фокусируйте объектив, глядя через окуляры, пока не появится изображение.

Поскольку все клетки были окрашены dpi, ядра должны быть легко наблюдаемы. Соберите изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений, на этом рисунке покровные листы с CPC и CPD были обработаны транспортным средством или одним микромоляром ингибитора SRC. SKI 6 0 6 в течение 24 часов клетки затем были закреплены и окрашены.

Согласно описанному протоколу, бета-катенин, обозначенный зеленым цветом, визуализировался с помощью специфического антитела и вторичного антитела, связанного с LOR 4 88, в то время как ядро окрашивали DPI, обозначенным синим цветом. Обратите внимание на изменение расположения бета-катенина от ядра к клеточной мембране. После лечения SKI 6 0 6.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как иммунофлуоресцентно окрашивать пищевод Барретта для исследования локализации белка или клеточной структуры.