Малый Порядок громкости для концентрации вируса из воды
3 февраля 2015 г.
Разработан подход к определению оптимальных условий концентрации вируса для проб воды небольшого объема с использованием шипов аденовируса человека. Описанные здесь методы используются для определения параметров концентрации для других вирусных мишеней и применяются для крупномасштабных экспериментов по концентрации вируса.
Общая цель следующего эксперимента заключается в оптимизации извлечения вируса из воды с использованием маломасштабного метода, первоначально разработанного для оптимизации концентрации вирусов. Было установлено, что стеклоцеллюлозный фильтр является наилучшим электроположительным фильтром для концентрирования аденовируса из воды. Для вторичного элюирования метод вторичного концентрирования с использованием целита оказался наиболее эффективным для вымывания аденовируса с поверхностей фильтра. Полученный метод обеспечивает максимальное извлечение аденовируса из водопроводной воды, поскольку продемонстрировал самый высокий процент восстановления среди всех протестированных комбинаций фильтров и способов элюирования.
Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как концентрирование больших объемов, является использование меньших объемов образцов, что позволяет быстро и легко оценить множество переменных концентрирования.
При подготовке к данному протоколу заранее приготовьте все необходимые растворы, включая вирусный раствор, отфильтрованный через мембрану с порами 0,22 micron, с концентрацией от 10 до 100 000 MPN на миллилитр.
Начните с отмеривания одного литра стерильной водопроводной воды. Перенесите ее в двухлитровый стакан с магнитным перемешивателем. При перемешивании добавьте 0,7 г тиосульфата натрия и дождитесь его полного растворения. Затем доведите pH до значения от 7 до 7,5, по каплям добавляя одномнолярные стоковые растворы кислоты или щелочи. Далее внесите в воду вирус. Добавьте один полный миллилитр приготовленного вирусного раствора. Накройте колбу стерильной пленкой и оставьте на 10 минут для перемешивания вируса с водой.
Тем временем подготовьте фильтр Millipore. Сначала распакуйте его и убедитесь, что верхняя чаша и нижнее сито плотно прилегают друг к другу. Затем проверьте, плотно ли пробковый материал фильтра прилегает к краю бокообразной колбы объемом 1 литр. Теперь снимите верхнюю чашу фильтра и с помощью пинцета аккуратно поместите электроположительный фильтрующий диск диаметром 47 мм по центру фильтрующего сита. Затем снова установите чашу и зафиксируйте ее, повернув против часовой стрелки.
Отмерьте 100 миллилитров обогащенной водопроводной воды с помощью стерильного цилиндра. Затем перенесите воду в подготовленный корпус фильтра на двухлитровой колбе. Электроположительный диск в фильтре может быть выполнен из плиссированной стеклоцеллюлозы или нано-оксидного алюминия на стекловолокне. Для удаления остатков воды через фильтр можно использовать слабый вакуум.
Теперь перенесите корпус фильтра в колбу с боковым отводом объемом 250 milliliter. Отмерьте 100 milliliters говяжьего экстракта и медленно вылейте его на фильтр. Дайте экстракту медленно пройти через фильтр, используя слабый вакуум для удаления остатков.
Затем перейдите к одному из двух вариантов вторичного концентрирования.
Для концентрирования вируса с помощью целита перенесите содержимое колбы объемом 250 milliliter, содержащее вирус, на магнитную мешалку. Используя магнитный якорь, создайте небольшую воронку. Затем добавьте 0,1 grams порошка целита в 100 milliliters говяжьего экстракта. Дождитесь диспергирования целита и подготовьтесь к корректировке pH растворов. По каплям добавляя 0,1 molar соляную кислоту, доведите pH до 4.0.
Затем перемешивайте раствор в течение 10 минут. Во время перемешивания установите предварительный фильтр объемом 47 мл на колбу объемом два литра. Теперь пропустите 100 мл смеси экстракта говядины и целита через предварительный фильтр. Для завершения процесса можно использовать слабый вакуум.
Затем установите металлический зажим для трубки на конец патрубка корпуса фильтра. К зажиму прикрепите стерильную полипропиленовую пробирку для сбора объемом 15 milliliter, после чего снова установите фильтр на колбу.
Теперь элюируйте вирус из частиц Celite, используя пять миллилитров 1X PBS при pH 9. Дайте большей части PBS стечь в пробирку объемом 15 миллилитров под действием силы тяжести, а остаток удалите с помощью слабого вакуума. Чтобы сконцентрировать вирус методом органической флокуляции, перенесите содержимое колбы объемом 250 миллилитров с вирусом на магнитную мешалку. С помощью магнитного якоря создайте небольшой вихрь. Доведите pH раствора до 3.5, добавляя по каплям одномолярную соляную кислоту. Затем перемешивайте смесь в течение получаса. После этого перенесите раствор в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 250 миллилитров. Центрифугируйте раствор при 2 500 g в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования соблюдайте осторожность при работе с пробирками, чтобы не разрушить осадок. Осторожно декантируйте супернадант и ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах PBS pH 9. Убедитесь, что осадок полностью растворился. Затем центрифугируйте суспензию при 4 000 g в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Теперь соберите супернадант, содержащий концентрированный вирус. Осадок можно утилизировать.
При оптимизации данного протокола сравнивали три типа целита. Использование целита с более крупными частицами приводило к более низкому выходу как ADV 40, так и ADV 41.
Элюцию с фильтра тестировали при значениях pH от 7,5 до 12, чтобы определить, какое из них будет наиболее эффективным для сбора частиц ADV с фильтров. Наивысший выход был получен при использовании стеклоцеллюлозного фильтра в сочетании с говяжьим экстрактом при pH 10 и с целитом. Результат был одинаковым для ADV 40 и ADV 41.
Было установлено, что говяжий экстракт при pH 10 превосходит органическую флокуляцию.
Оптимизированный метод сравнивали с добавлением 25% трипсина, а также с дополнением говяжьего экстракта 0,1% полифосфатом натрия. Ни один из вариантов обработки не привел к значимому улучшению выхода ADV.
После освоения эта методика может быть выполнена за 45 минут при условии правильного проведения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод оптимизации извлечения вирусов из проб воды малого объема, в частности, с акцентом на аденовирус человека. Подход основан на использовании стеклянно-целлюлозного фильтра и метода вторичного концентрирования для повышения степени извлечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Экология
- Качество воды
Теоретические сведения
- Концентрирование вирусов из проб воды имеет решающее значение для экологического мониторинга.
- Существующие методы часто требуют больших объемов образцов, что ограничивает их эффективность.
- Оптимизация методов извлечения может улучшить обнаружение и анализ вирусных патогенов.
- Аденовирус человека служит моделью для тестирования методов концентрирования.
Цель исследования
- Разработать методику определения оптимальных условий концентрирования вируса.
- Оценить различные комбинации фильтров и способов элюции для выделения аденовируса.
- Обеспечить возможность быстрой оценки переменных концентрирования с использованием малых объемов образцов.
Используемые методы
- Использование целлюлозного фильтра из стекловолокна для концентрирования аденовирусов.
- Применение метода вторичного концентрирования Sea Light для элюции.
- Сравнение различных комбинаций фильтров и способов элюции.
- Оценка степени извлечения из проб водопроводной воды.
Основные результаты
- Стеклянный целлюлозный фильтр продемонстрировал самые высокие показатели восстановления аденовируса.
- Метод вторичного концентрирования sea light обеспечил эффективное элюирование вируса.
- Малые объемы образцов позволили быстро оценить несколько параметров концентрирования.
- Данный метод оказался эффективнее традиционных методов концентрирования больших объемов.
Выводы
- Данный метод обеспечивает более эффективный способ выделения вирусов из проб воды.
- Он позволяет быстро протестировать различные условия концентрирования.
- Этот подход может быть адаптирован для других вирусных мишеней, помимо аденовируса.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Оптимизация извлечения вирусов из проб воды малого объема позволяет быстро проводить скрининг параметров концентрирования, что способствует разработке методов анализа на ранних этапах в экологической вирусологии. Данный метод представляет собой масштабируемый и экономически эффективный подход к оценке комбинаций фильтров и элюентов, сокращая затраты ресурсов в рабочих процессах доклинического обнаружения патогенов. Определение оптимальных условий для концентрирования аденовируса с помощью данной методики повышает прогностическую достоверность последующих приложений по детекции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет оценить эффективность извлечения вирусов при использовании различных типов фильтров и условий элюции для подтверждения целевых показателей при детекции патогенов в окружающей среде.
- Практическая ценность: использование малых объемов образцов (1–10 L, имитируемых 100 mL) для быстрого тестирования множества переменных ускоряет формулирование гипотез по оптимизации концентрирования вирусов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получить количественные данные о выходе (процент восстановления AdV40 и AdV41) для обеспечения стандартизации и воспроизводимости анализа в платформах по обнаружению вирусов.
- Практическая ценность: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем (концентрированный вирус в объеме 5-30 mL) для последующего применения, такого как тесты на инфекционность или геномный анализ.
- Стратегическая ценность: способствует готовности к скринингу, обеспечивая быстрое сравнение электроположительных фильтров (стекло/целлюлоза против нано-оксида алюминия/стекла) и методов вторичного концентрирования (келит против органической флокуляции).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: использование аденовируса человека в качестве релевантной модели заболевания для оценки эффективности методов концентрирования, что способствует разработке трансляционных биомаркеров для патогенов, передающихся через воду.
- Операционная ценность: обеспечение непрерывности процесса от этапа обнаружения до доклинической валидации путем получения концентрированного вируса, пригодного для дальнейшей характеризации.
- Стратегическая ценность: содействие принятию обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении за счет выявления комбинаций фильтрации и элюции с высоким выходом (стеклоцеллюлозный фильтр с говяжьим экстрактом при pH 10 и sea light).
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в непрерывный процесс исследований — от первоначальной проверки гипотез до идентификации ведущих показателей при обнаружении патогенов в окружающей среде, что позволяет быстро подбирать оптимальные значения концентрации перед переходом к работе с большими объемами.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез относительно переменных фильтрации и элюции для выяснения механизмов высвобождения вируса с поверхностей и оптимизации эффективности извлечения.
- Скрининг: позволяет получать готовые для анализа концентраты вируса (5-30 mL) с количественными показателями (процент извлечения) для сравнения условий при использовании различных типов фильтров и добавок для элюции.
- Аналитика: позволяет измерять зависимые переменные (извлечение вируса с помощью qPCR или инфекционность) для статистической оценки влияния независимых переменных (тип фильтра, pH элюции, размер частиц целита).
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническим этапом, предоставляя концентрированный аденовирус, пригодный для последующей валидации на клеточных культурах или моделях животных.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного применения метода для оптимизации концентрирования различных вирусных мишеней, помимо аденовируса, что сокращает объем избыточной разработки методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность методов выделения вирусов за счет снижения механистической неопределенности посредством систематической оценки параметров фильтрации и элюции.
- Практическая ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость за счет четко определенных этапов (элюция говяжьим экстрактом, вторичное концентрирование с использованием Sea Light, доведение pH до 4.0) и количественно определяемых конечных точек (процент восстановления AdV40 и AdV41).
- Стратегическая ценность: Оптимизирует процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки анализов по обнаружению патогенов путем определения оптимальных условий (стеклоцеллюлозный фильтр, говяжий экстракт при pH 10, Sea Light), при которых наблюдается максимальный процент восстановления.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает приоритизацию методов концентрирования для программ экологического мониторинга с учетом рисков, что снижает вероятность неудач на поздних этапах рабочих процессов по обнаружению патогенов.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области вирусологии, методов фильтрации и прецизионного дозирования жидкостей для этапов внесения вируса, сборки фильтров и центрифугирования.
- Использование оборудования, включая системы вакуумной фильтрации, магнитные мешалки, pH-метры, центрифуги (способные развивать ускорение 2,500 G и 4,000 G), а также стерильные трубки и пробирки для сбора.
- Необходима межгрупповая стандартизация приготовления растворов (говяжий экстракт, целит, HCl, PBS) и контроля условий среды (центрифугирование при 4°C, стерильные условия) для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При применении метода к различным типам вирусов или водным матрицам следует учитывать необходимость адаптации, так как эффективность извлечения может варьироваться в зависимости от свойств вируса (например, серотипа аденовируса) и состава образца (водопроводная вода в сравнении с природными источниками).
- Практические ограничения включают необходимость соблюдения правил асептики при работе с вирусом и возможную вариабельность характеристик фильтров от партии к партии, что может повлиять на стабильность элюции.
