Real-Time Сопротивление на основе Cell Analyzer как инструмент, чтобы очертить молекулярных путей, участвующих в нейротоксичности и Нейропротекция в клеточной линии нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать технику, основанную на импедансе, для отслеживания цитозащиты линии нейронных клеток в реальном времени, чтобы определить участие вторых мессенджерных путей в процессе защиты. Это достигается путем предварительного культивирования нейронной клеточной линии в условиях пролиферации в клеточном анализаторе реального времени на основе импеданса. На втором шаге потенциально актуально.

Вторичные пути посредников фармакологически ингибируются перед тем, как подвергнуть клеточную линию нейропротекторному лечению. Затем с помощью клеточного анализатора в реальном времени в различных экспериментальных условиях отслеживается состояние нейронной клеточной линии. В конечном счете, статистический анализ может быть использован для оценки участия вторых мессенджеров в цитозащите нейрональных клеток в режиме реального времени.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как анализ нейротоксичности в конечных точках, заключается в том, что он позволяет оценивать защиту и токсичность Tito в нейрональных клеточных линиях в режиме реального времени и в условиях без меток. Этот метод может помочь ответить на быстрые вопросы в области молекулярной нейробиологии, способствуя более высокопроизводительной оценке потенциальных нейропротекторных соединений in vitro и обеспечивая понимание молекулярных механизмов, участвующих в нейропротекции. Например, здесь клетки нейробластомы человека S-K-N-S-H используются с PBS, а затем трипсин клеток в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия.

Удалите трипсин центрифугированием, а затем повторно суспендируйте клетки в 10 миллилитрах пролиферирующей среды. После подсчета клеток разбавляют клетки до концентрации от трех до 10 до пятой части на миллилитр с большей пролиферирующей средой, затем уравновешивают каждую лунку EPL 96 со 100 микролитрами пролиферирующей среды в тканевом культурном колпаке при комнатной температуре. Через 30 минут вставьте EPL 96 в станцию анализа клеток в реальном времени в инкубаторе углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия и запустите программное обеспечение для анализа клеток в режиме реального времени.

Затем на странице макета выберите подходящие лунки для эксперимента и введите тип клетки, номер ячейки, а также названия и концентрации интересующих химических соединений в поля редактирования на странице программного обеспечения для расписания, как только будет установлен первый шаг. Для фонового измерения выберите «Добавить шаг» и установите второй шаг, чтобы измерять индекс ячейки каждые 15 минут в течение 96 часов. Затем нажмите «Пуск», чтобы начать первый шаг и измерить фоновое сопротивление носителя.

Теперь удалите ЭПЛ и добавьте 100 микролитров суспензии клеток нейробластомы. В каждую экспериментальную лунку аккуратно закрутите EPL 96, чтобы равномерно покрыть лунки, а затем инкубируйте планшет при комнатной температуре в шкафу для культуры тканей, чтобы клетки могли осесть через полчаса, загрузите EPL 96 обратно в станцию клеточного анализатора в реальном времени и начните второй этап. Чтобы отслеживать значения клеточного индекса на протяжении всего эксперимента, просматривайте кривые ячеек на странице графика и необработанные данные клеточного индекса на странице клеточного индекса в течение 24 часов.

После нанесения покрытия на клетки приостановите эксперимент и снимите пластину со станции анализа клеток в реальном времени. Внесите по одному микролитру свежеразведенных ингибиторов, представляющих интерес, в каждую лунку, затем, после повторной загрузки EPL 96, возобновите экспериментальные измерения клеточного индекса через 30 минут, снова приостановите эксперимент и быстро, но осторожно удалите пролиферирующую среду из каждой лунки, направив край наконечника пипетки к углу лунки, чтобы избежать нарушения адгезивного клеточного слоя. Затем немедленно добавьте в каждую лунку по 200 микролитров среды для депривации сыворотки, по одному микролитру свежеразведенных нейропротекторных соединений, представляющих интерес, и по одному микролитру интересующих ингибиторов второго мессенджерного пути.

Затем продолжайте измерения клеточного индекса каждые 15 минут в течение 96 часов, как было установлено ранее, для анализа данных, теперь выберите нормализованный клеточный индекс и нормализованное время на странице графика, чтобы нормализовать клеточный индекс до последней временной точки перед изменениями в клеточной культуре. Чтобы уменьшить разброс между экспериментами. Выделите лунки на странице графика для интересующих экспериментальных условий и нажмите кнопку Добавить, чтобы построить кривые нормализованных клеточных индексов.

Затем экспортируйте экспериментальные данные для всех временных точек индекса клеток со страницы программного обеспечения индекса клеток в файл электронной таблицы для статистического анализа различий в значениях индекса клеток при различных условиях обработки в определенные моменты времени. Выберите значения индекса ячеек в соответствующих временных точках в экспортированном файле таблицы. Наконец, проанализируйте значения клеточного индекса для выбранных временных точек с одно- или двухсторонним дисперсионным анализом с последующим апостериорным тестом. Используя статистическое программное обеспечение, нейротоксические стимулы к клеткам приводят к снижению значений клеточного индекса при выращивании клеток S-K-N-S-H при выращивании клеток в пролиферативной среде и падению клеточного индекса с последующей стабилизацией на новых более низких уровнях после Переключение клеток на среду депривации сыворотки показано на этих графиках.

Может наблюдаться нейропротекторный эффект двух агонистов серотонина, двух рецепторов, пяти микромоляров, DOI и 20 микромолярного IDE, добавленных при скармливании клеток с депривацией сыворотки, среды. Важным вопросом в исследованиях нейропротекции является вопрос о том, способствует ли влияние на пролиферацию клеток наблюдаемому эффекту соединения на выживаемость клеток. На этом графике показано отсутствие влияния лечения пятью микромолярными DOI на пролиферацию клеток SKNS, что позволяет предположить, что пролиферация не способствует наблюдаемому нейропротекторному эффекту.

На этом заключительном графике можно наблюдать влияние лечения 10 микролярами ингибитора фосфатидилначальных трех киназ LY 2 9 4 0 0 2 на выживаемость клеток и нейропротекторное действие DOI на сывороточные клетки SK NSH. LY 2 9 4 0 0 2 предотвращал нейропротекторный эффект DOI на стадии сывороточной депривации, но также проявлял некоторое собственное токсическое действие. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как следить за защитой CTO в линии нейронных клеток с помощью клеточного анализатора в реальном времени, а также очертить участие вторых мессенджеров в защите.