Real-Time Сопротивление на основе Cell Analyzer как инструмент, чтобы очертить молекулярных путей, участвующих в нейротоксичности и Нейропротекция в клеточной линии нейронов

Общая цель данной процедуры заключается в использовании метода импедансного анализа для мониторинга цитопротекции нейрональной клеточной линии в режиме реального времени, чтобы определить роль путей вторичных посредников в процессе защиты. Это достигается путем первоначального культивирования нейрональной клеточной линии в условиях пролиферации в анализаторе клеток в режиме реального времени на основе импеданса. На втором этапе исследуются потенциально значимые.

Перед воздействием нейропротекторных препаратов на клеточную линию фармакологически ингибируют пути вторичных посредников. Затем с помощью анализатора клеток в режиме реального времени отслеживают состояние нейрональной клеточной линии при различных экспериментальных условиях. В конечном итоге статистический анализ позволяет оценить участие путей вторичных посредников в цитопротекции нейрональных клеток в режиме реального времени.

Главным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как конечные анализы нейротоксичности, является то, что она позволяет оценивать нейропротекцию и нейротоксичность в клеточных линиях нейронов в режиме реального времени и без использования меток. Данный метод может помочь в быстром решении вопросов в области молекулярной нейробиологии, способствуя более высокопроизводительной оценке потенциальных нейропротекторных соединений in vitro и обеспечивая понимание молекулярных механизмов, участвующих в нейропротекции. Начните с промывки слоя адгезивной клеточной линии нейронов. Например, в данном случае клетки нейробластомы человека S-K-N-S-H промывают PBS, затем обрабатывают клетки трипсином в течение пяти минут при 37 °C.

Удалите трипсин путем центрифугирования, затем ресуспендируйте клетки в 10 мл пролиферационной среды. После подсчета клеток доведите их концентрацию до 3 × 10⁵ клеток/мл, добавив пролиферационную среду, затем в тисокультурном боксе при комнатной температуре уравновесьте каждую лунку планшета EPL 96, добавив 100 µL пролиферационной среды. Через 30 минут поместите планшет EPL 96 в станцию анализатора клеток в реальном времени в инкубаторе с CO2 при 37 °C и запустите программное обеспечение анализатора клеток в реальном времени.

Затем на странице схемы расположения выберите подходящие лунки для эксперимента и введите тип клеток, количество клеток, а также названия и концентрации интересующих химических соединений в поля редактирования на странице программного обеспечения для планирования, так как первый шаг предустановлен. Для измерения фонового значения выберите «добавить шаг» (add a step) и установите в шаге два измерение индекса клеток каждые 15 минут в течение 96 часов. Затем нажмите «пуск» (start), чтобы запустить первый шаг и измерить фоновый импеданс среды.

Теперь удалите EPL и добавьте 100 µL суспензии клеток нейробластомы. Аккуратно встряхните планшет EPL 96 в каждом экспериментальном лунке для равномерного распределения клеток, затем инкубируйте планшет при комнатной температуре в ламинарном шкафу для культивирования тканей; спустя полчаса, когда клетки осядут, установите EPL 96 обратно в станцию анализатора клеток в реальном времени и перейдите ко второму этапу. Для мониторинга значений индекса клеток на протяжении всего эксперимента отслеживайте кривые роста клеток на странице графиков и необработанные данные индекса клеток на странице индекса клеток в течение 24 часов.

После посева клеток приостановите эксперимент и извлеките планшет из станции анализа клеток в режиме реального времени. Добавьте по 1 µL свежеразведенных интересующих ингибиторов в каждую лунку, затем, после повторной установки EPL 96, возобновите измерения индекса клеток через 30 минут. Снова приостановите эксперимент и быстро, но осторожно удалите пролиферационную среду из каждой лунки, направляя кончик пипетки в угол лунки, чтобы не повредить слой адгезивных клеток. Затем немедленно добавьте в каждую лунку 200 µL среды для сывороточного голодания, 1 µL свежеразведенных интересующих нейропротекторных соединений и 1 µL интересующих ингибиторов путей вторичных посредников в соответствующие лунки.

Затем продолжайте проводить измерения индекса клеток каждые 15 минут в течение 96 часов, согласно ранее установленным параметрам. Чтобы проанализировать данные, выберите на странице графиков функции «normalized cell index» (нормированный индекс клеток) и «normalized time» (нормированное время), чтобы привести индекс клеток к значению последней временной точки перед внесением изменений в клеточную культуру. Это позволит уменьшить вариабельность между экспериментами. Выделите на странице графиков лунки, соответствующие интересующим вас экспериментальным условиям, и нажмите «add», чтобы построить кривые нормированного индекса клеток.

Затем экспортируйте экспериментальные данные для всех временных точек индекса клеток со страницы программного обеспечения для определения индекса клеток в файл электронной таблицы для статистического анализа различий значений индекса клеток при разных условиях обработки в определенные моменты времени. В экспортированном файле электронной таблицы выберите значения индекса клеток для соответствующих временных точек. Наконец, проанализируйте значения индекса клеток для выбранных временных точек с помощью одно- или двухфакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом с использованием статистического программного обеспечения. Нейротоксические стимулы, воздействующие на клетки, приводят к снижению значений индекса клеток; на данных графиках показано увеличение индекса клеток при выращивании клеток S-K-N-S-H в пролиферационной среде, а также последующее падение индекса клеток с его стабилизацией на новом более низком уровне после перевода клеток в среду с депривацией сыворотки.

Можно наблюдать нейропротекторный эффект двух агонистов серотониновых 2A-рецепторов — DOI в концентрации 5 µM и IDE в концентрации 20 µM, добавленных при культивировании клеток в среде с ограничением содержания сыворотки. Важным вопросом в исследованиях нейропротекции является то, способствует ли влияние на пролиферацию клеток наблюдаемому действию соединения на выживаемость клеток. На данном графике показано отсутствие влияния обработки клеток SKNS 5 µM DOI на их пролиферацию, что свидетельствует о том, что пролиферация не вносит вклада в наблюдаемый нейропротекторный эффект.

На этом заключительном графике можно наблюдать влияние обработки 10 µM ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы LY 2 9 4 0 0 2 на выживаемость клеток и нейропротекторный эффект DOI на клетках SK NSH в условиях дефицита сыворотки. LY 2 9 4 0 0 2 предотвратил нейропротекторный эффект DOI на этапе депривации сыворотки, а также проявил собственный токсический эффект. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как отслеживать нейропротекцию в линии нейрональных клеток с помощью анализатора клеток в реальном времени и как определять участие путей вторичных посредников в этом процессе.