Одновременные Долгосрочные Записи на двух этапах нейронов обработки своем поведении медоносных

Общая цель этой процедуры заключается в изучении обонятельного покрытия и формирования памяти с использованием долгосрочного доступа к двум независимым стадиям нейронной обработки у ведущих себя медоносных пчел. Это достигается путем предварительной сборки недорогих многоканальных электродов из изолированных медных микропроводов и изготовленных по индивидуальному заказу держателей. Следующим этапом является подготовка живой медоносной пчелы путем удаления части ее головной капсулы для вставки двух электродов, обработанных флуоресцентным красителем, в обнаженный мозг.

Третий шаг заключается в записи от двух независимых нейротаблеток или трактов в обонятельном пути, стимулируя при этом цветочными запахами и феромонами. Позже, после вскрытия мозга, в лепесток антенны вводится другой флуоресцентный индикатор для заполнения целевых нейронов. Затем засыпанные дорожки и трассировки электродов визуализируются для получения трехмерной реконструкции нейронной архитектуры.

В конечном счете, с помощью этих методов можно лучше понять взаимоотношения в оболочке запаха между двумя популяциями нейронов на разных уровнях обработки, такими как лепесток антенны и тело гриба. Таким образом, основные преимущества этой техники из существующих методов заключаются в том, что наши многоканальные электроды очень маленькие и могут использоваться в комбинации, что означает, что мы можем записывать одновременно в разных областях мозга после того, как они будут закреплены. Гибкие провода позволяют животным сохранять устойчивость в течение нескольких часов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области невропатологии, такие как понимание того, как животные получают, воспринимают и, в конечном итоге, вычисляют olf-фабрики в жизни из окружающей среды. Этот метод двойной записи может дать представление о механизме, лежащем в основе кодирования запаха и нейронных сетей в целом. Он также может быть применен к другим модельным организмам в области беспозвоночных или нейробиологии.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется много тренировок, чтобы идентифицировать нейроны медоносной пчелы, используя только морфологические ориентиры, такие как внутренняя доля или вертикальная доля тела гриба. Для этого протокола необходимо создать адаптер электрода, подходящий для стандартной интерфейсной платы электродов. Сначала припаяйте три коротких отрезка изолированных проводов к 18-контактному разъему.

Затем отрежьте кусок пластины из плексигласа и вставьте неглубокую канавку по самой длинной стороне. Далее вкрутите паяльные наконечники в пластину из плексигласа и приклейте пластину к верхней части разъема. Затем соедините основание с наконечниками с помощью трех коротких проводов.

Затем поместите стеклянный капилляр в углубление пластины из плексигласа. Капилляр должен иметь возможность скользить и быть закреплен винтом С помощью мельчайшего штифта выдвиньте стеклянный капилляр наружу примерно на пять миллиметров. Капилляр и штифт будут использоваться для поддержки и стабилизации микропроводов электрода.

Далее расположите три микропровода. С помощью скотча для лучшего доступа стеклянный капилляр можно удалить с помощью игольчатого клея на 12 вольт. Провода вместе со стоматологическим воском LMP не склеивают последнюю треть проводов.

Теперь подключите эту многоканальную микропроводную сборку к электродному адаптеру. Расположите расширенный стеклянный капилляр параллельно микропроводам. Закрепите эту насадку стоматологическим воском вдоль перекрывающегося стеклянного капилляра и минутного штифта.

Затем обрежьте электродные провода, оставив два-три сантиметра, отходящие от мельчайшего штифта, и два-три сантиметра, отходящие от конца электрода. Далее закрепите капилляр в электродном адаптере и с помощью винта стабилизируйте все на месте. При 360 градусах по Цельсию.

Концы проводов припаяйте перпендикулярно наконечникам. Затем проверьте наличие достаточно сильного электрического контакта, убедившись, что их импеданс составляет около 300 килоОм при частоте в один килогерц. Теперь подсоедините каналы адаптера второго электрода к ведущему электроду и припаяйте предыдущий и мышечный электроды к основанию главного электрода.

Наконец, установите главный электрод на интерфейсную плату головного столика. Закрепите второй электрод на отдельном переходнике, после получения медоносные пчелы охладите один на льду до тех пор, пока он не будет обездвижен. Далее закрепите пчелу в стандартном держателе из оргстекла с открытой головой.

Нанесите нагретый стоматологический воск на основание глаз и стык между головой и грудной клеткой, таким образом закрепив голову. Продолжайте использовать воск для обездвиживания черешкового глаза усиков на головной капсуле. Избегайте нанесения воска на фагель, который должен быть направлен вперед.

Pro Bois не должен быть ущемлен. Убедитесь, что он может двигаться. Теперь побрейте голову капсулой, чтобы улучшить доступность.

Затем накормите пчелу всеми 30%-ными сахарозами, которые она будет потреблять. Это обеспечивает хорошую подготовку, жизнеспособность и увлажненность тканей. Теперь с помощью микроскальпеля разрежьте вертикально вдоль границы глаза и горизонтально над основаниями антенн

Продолжайте резать под глазом О-клетки и удалите отпавшую кутикулу. Гипофарингеальные железы должны быть отодвинуты в сторону, как и трахея. Это освободит путь для введения электрода.

Начните со вставки электрода сравнения, серебряной проволоки толщиной 35 микрон. Сначала сделайте небольшой надрез в ипсилатеральном составном глазу. Затем проденьте через него электрод.

Затем вставьте вторую проволоку в область проекции мышц ниже латерального глаза О-клеток. Чтобы в дальнейшем визуализировать положение электродов, опустите электроды в раствор 0,5 молярного хлорида калия и 5% Alexa Hydrocyte 4 88 на три минуты. Затем с помощью микроманипуляторов поместите два электрода в мозг.

Сориентируйтесь, определив лепесток антенны и вертикальный лепесток тела гриба. Здесь один электрод находится в латеральном лепестковом тракте антенны глубиной 180 мкм, а другой — в медиальном лепестковом тракте. Вставляется на глубину около 300 мкм.

Завершите установку электродов, закрепив их с помощью двух компонентов. Силикон покрывает все пространство над мозгом, что также предотвратит пересыхание тканей. Затем приступайте к записи для извлечения единичной активности из записанного внеклеточного сигнала.

Используйте доступное программное обеспечение для сортировки шипов. Используйте дифференцированные электродные каналы. Применяйте методы согласования шаблонов одновременно на всех трех каналах электродов для обнаружения различных комбинаций сигналов, которые учитывают события одного всплеска.

И, наконец, контроль за правильным разделением блоков. Использование метода принципиальных компонент на одиночных спайковых событиях трех зарегистрированных дифференцированных электродных каналов. После записи аккуратно снимите с пчелы силикон и электроды.

Далее промойте мозг раствором пчелиного кольца и удалите железы и трахею. Затем с помощью микропипетки вводят в лепесток антенны, 5% микрорубина растворяют в одном моляре ацетата калия. Это обеспечит антероградную метку на следах доли

С этого момента выполняйте все шаги в максимальной темноте. Промойте мозг пчелиными кольцами еще раз, три раза, и дайте красителю инкубироваться в течение 30-45 минут. Обездвижите пчелу, охладив ее в холодильнике.

Затем изолируйте мозг. Зафиксируйте мозг в 4%Para альдегиде в 0,1 моляра PBS на ночь при четырех градусах Цельсия и с легким взбалтыванием. После обратного заполнения проекционных нейронов в лепестке антенны микрорубиновым индикатором, проекционное изображение этих нейронов было собрано из орто-срезов вдоль оси Z.

Краситель Alexa Hydrocyte 4 88 на двух электродах показывает их введение в медиальную долю антенны и в тракт латеральной доли антенны. С помощью 3D-реконструкции окрашенных клеток-мишеней и мест вставки электродов была сделана схема траекторий двух отводов лепестков антенны, одновременная регистрация с двух лепестков антенны при стимуляции пчелы различными концентрациями запаха была использована для исследования временной обработки. Активность оценивалась на последующих этапах обработки.

Анализ проекционных нейронов лепестков антенны и принципиальных компонент внешних нейронов популяционных векторов показывает, что запах в проекционных нейронах был продолжительным и переживал стимул. В отличие от этого, в популяции внешних нейронов были представлены только типы «запах включен» и «запах выключен». Таким образом, при наблюдении активности во времени внешняя популяция нейронов справа проявляет активность разделения запахов незадолго до того, как проекционная популяция нейронов начинает развивать свою индуцированную запахом активность.

Стимуляция запаха отмечена серым цветом. После освоения требуется около 30 минут, чтобы построить электрод. Подготовка пчелы и вставка электродов в целевые участки может быть выполнена еще через полчаса, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что каждый шаг требует много практики и терпения, пока он не будет освоен. Будьте особенно осторожны при подтягивании электродных проводов к точкам их подключения и записи с нужной досягаемости мозга. Это требует глубоких знаний анатомии мозга медоносной пчелы после ее развития.

Этот метод позволил исследователям в области невропатологии и обоняния насекомых изучить точные временные отношения между активностью различных нейронных путей и мозговых центров в поведении медоносных пчел. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конструировать и использовать многоканальные микропроволочные электроды для одновременной записи из двух областей мозга и поведения медоносных пчел. Вы также должны иметь возможность визуализировать точное расположение записывающих электродов.