Живая съемка Дрозофилы Личиночные нейробласты

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подробно описать вскрытие интактной ЦНС из личинок третьего возраста офа. С целью изучения асимметричного деления стволовых клеток, клеточной дифференцировки и морфогенеза. Это достигается путем первичной посадки ЦНС из тела личинки путем грубого вскрытия.

Второй шаг заключается в выделении интактного мозга из периферических тканей с помощью тонкой микродиссекции с использованием специально изготовленных инструментов. Затем здоровый мозг либо монтируется для визуализации живых клеток, либо подвергается химической фиксации и иммунофлуоресценции, в конечном итоге используется конфокальная микроскопия вращающегося диска, чтобы показать события, которые управляют делением нервных стволовых клеток и обеспечивают механистическое понимание развития ЦНС. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака стволовых клеток и развития нервной системы.

Внося свой вклад в наше понимание того, как регулируется пролиферация стволовых клеток, мы знаем, что деление стволовых клеток ABER связано с опухолегенезом и микроцефалией, а наши исследования визуализации раскрывают механизмы, которые регулируют эти деления стволовых клеток. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что микродиссекция и монтирование мозга трудно освоить, так как они требуют твердых рук, терпения и практики. Начните эту процедуру с того, что нанесите две капли теплого препарирующего материала на одно предметное стекло, одну для грубого препарирования, а другую для тонкого препарирования.

Затем переложите несколько личинок в одну из сред капель. После этого перенесите предметное стекло с личинками в препарирующий микроскоп. Теперь увеличьте каплю с личинками так, чтобы были видны передний и задний концы личинок.

Захватите среднюю область одной личинки парой щипцов и захватите другую область рядом с ней с помощью второй пары щипцов. Затем разорвите личинки пополам. Повторите процедуры для всех личинок на покрове, проскользните и утилизируйте задние половинки.

Увеличьте масштаб личинки так, чтобы передние крючки рта были хорошо видны. После этого сделайте небольшой надрез или выемку на противоположной стороне от личиночного рта крючков между третьим грудным и первым брюшным поясами CLE. Далее возьмитесь за крючки для рта щипцами.

Аккуратно отклейте кутикулу в переднем и заднем направлении и продолжайте до тех пор, пока ЦНС не обнажится. Затем разорвите ткани, чтобы изолировать ЦНС от остальных личинок. Будьте осторожны, чтобы не повредить ЦНС и выбросьте поврежденные образцы с разорванным вентральным нервным канатиком или искривленными зрительными долями.

Повторите процедуры для всех личинок на покровном листе. Затем перенесите здоровую эксплантированную ткань в другую чистую среду. Опустите крышку на крышку для тонкого препарирования.

С помощью рассекающих штифтов удалите периферические ткани из мозга. Проведите скальпель между мозгом и ненужной тканью и прикрепите соединительную ткань к предметному стеколу. Используйте крючок, чтобы аккуратно удалить нежелательную ткань, одновременно прижимая скальпель к покровному листу движениями качелей.

Работайте медленно и целенаправленно, чтобы удалить все диски из каждого мозга. Соблюдайте осторожность, чтобы не нарушить морфологию мозга. Здоровый мозг будет иметь неповрежденный вентральный нервный канатик и симметричные круглые зрительные доли.

Теперь переверните 50-миллиметровую газопроницаемую чашку для культуры прозрачной пленкой вверх и нанесите небольшую каплю среды на центр чашки. Затем с помощью крючка зачерпните мозги под лепестками зрительного нерва и переложите их в каплю среды на блюде одну за другой. Соберите от пяти до 10 мозгов в дропе медиума.

Затем опустите их на дно по одному, так как многие из них впоследствии окажутся в ловушке мениска. Ориентируйте мозг так, чтобы нейробласт можно было визуализировать, чтобы визуализировать передний вентральный нейробласт. Поместите мозг так, чтобы вентральный нервный канатик был направлен вверх, выровняйте мозг так, чтобы все вентральные нервные канатики указывали в одном направлении в плоскости XY.

С помощью шприца или пластиковой переводной пипетки поместите четыре капли углекислого масла гало на газопроницаемую мембрану. Объем каждой капли масла должен быть эквивалентен друг другу и капле среды. После завершения пять капель будут напоминать пять граней на игральных костях в западном стиле.

Затем опустите на узел защитный лист так, чтобы он попадал на все пять капель одновременно. Поддержание равномерного давления на образцах снижает вероятность их разрушения. Подождите около трех минут.

По мере того, как масло и среда диспергируются под тяжестью крышки, проскальзывают под рассекающий прицел. Опустите покровный лист на поверхность мозга дальше, удаляя излишки среды с помощью фитиля из папиросной бумаги до тех пор, пока покровный листок не коснется его, мозг не переборщит, так как это вызовет искажение тканей или взрыв мозга для изображения переднего вентрального нейробласта. Покровное слип необходимо немного сдвинуть в направлении кончиков вентрального нервного канатика.

Это заставляет мозг вращаться, что приводит доли мозга в прямой контакт с покровным стеклом для облегчения визуализации, впоследствии герметизирующей камеру enc. Крышка скользит с небольшим количеством гало-углеродистого масла. Излишки масла, сочащиеся из покровного стекла, следует свести к минимуму и промокнуть салфеткой.

Перед визуализацией. Добавьте каплю иммерсионного масла на защитный лист прямо над установленными мозгами, чтобы объектив располагался непосредственно над образцом. Аккуратно поместите смонтированный образец в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия и накройте камеру крышкой.

Затем определите местоположение центрального нейробласта мозга с помощью проходящего света, сосредоточившись на больших круглых клетках, которые находятся в центральной и медиальной областях зрительных долей. После того, как он будет на месте, сделайте быстрые экспозиции с помощью конфокального фильтра, чтобы определить правильное местоположение и глубину нейробласта. Ограничьте глубину до первых 10-15 микрометров.

При необходимости отрегулируйте и сделайте еще одно тестовое изображение. Чтобы устранить снос оси, используйте устройство непрерывной автоматической фокусировки, в котором используется инфракрасный светодиод, или вручную корректируйте фокальную плоскость. После того, как интересующий вас нейробласт будет идентифицирован, оптимизируйте все параметры перед визуализацией.

Теперь визуализируйте весь нейробласт, собрав от 12 до 14 изображений, расположенных на расстоянии одного микрометра по оси Z. Отрегулируйте временное разрешение, чтобы захватить один или несколько клеточных циклов одного и того же нейробласта. Используйте интервалы от 10 до 32 для визуализации одного клеточного цикла и интервалы от одной до трех минут для нескольких клеточных циклов.

Затем подтвердите, что образец здоров, отслеживая продолжительность митоза. Если митоз занимает более 15 минут, переходите к другому мозгу. Здоровый мозг будет показывать множество нейробластов в одном и том же поле зрения, проходя несколько раундов митоза.

После завершения визуализации разберите инкубационную камеру и выбросьте все, кроме газопроницаемых емкостей для культивирования. Промойте поверхность чашки для культуры 95% этанолом и протрите масло салфеткой. Повторите процедуру еще два раза.

Здесь показана живая визуализация деления стволовых клеток нейробластов в цельных препаратах. Это покадровые изображения одного клеточного цикла от нейробласта, экспрессирующего GFP Мосина, для тонкого клеточного анализа, один клеточный цикл нейробласта визуализируется менее чем через 32-й интервал времени. И это покадровые изображения последовательных циклов деления клеток из нейробласта, экспрессирующего как G-F-P-M-O, так и маркер центросомы, меченный GFP.

Для визуализации множественных циклов клеток нейробластов. Мозг обычно визуализируется с интервалом от одной до трех минут в течение двух-трех часов. Здесь показаны конфокальные проекции фиксированных стволовых клеток из домашних препаратов.

Для визуализации всего нейробласта, расположенного на обеих лепестках зрительного нерва, используется 20-кратное увеличение. Этот анализ особенно полезен для изучения общей морфологии мозга и количественной оценки числа нейробластов. Большая часть нейробластов из одной оптической доли может быть визуализирована с 40-кратным увеличением.

Для детального клеточного анализа нескольких нейробластов необходимо использовать 100-кратное увеличение. Этот мутантный нейробласт показывает несколько центросом на каждом полюсе веретена. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, чтобы избежать повреждения фотографий, ограничив количество света, попадающего на образец.

Этот метод визуализации деления живых нейробластов в цельных препаратах проложил путь исследователям в области биологии стволовых клеток к изучению асимметричного деления клеток в живом нативном контексте развивающегося мозга дрозофилы.