Руководство по В естественных условиях Регистрация отдельных единиц из Optogenetically Идентифицировано корковых ингибиторной интернейронов

Общей целью данного эксперимента является получение высококачественных внеклеточных записей одиночных единиц от корковых интернейронов у мышей, экспрессирующих корневой канал два. Это достигается за счет продвижения записывающего электрода с высоким импедансом через ткань для идентификации интернейронов по пиковым реакциям на импульсы синего света. Электрический сигнал контролируется на предмет изменений, которые указывают на соответствующую скорость опережения и вероятность получения стабильной хорошо изолированной записи.

Если не удается достичь хорошей изоляции одной единицы или, наоборот, редко встречаются светочувствительные нейроны, замените записывающий электрод. Результаты показывают, что достоверность света вызывает отклики оптически идентифицированных нейронов и типичное соотношение сигнал/шум, полученное с помощью этой стратегии. Подход фотостимуляции является доступным и недорогим способом воздействия на генетически идентифицированные типы клеток с использованием стандартного внеклеточного усилителя и синего света.

Это наша стратегия для сутенерства определенных внутренних нейронов в анестезирующей слуховой коре, но более общие моменты относятся к другим областям коры, а не к редким типам клеток. После того, как животное было обезболено коктейлем кетамина с помощью внутрибрюшинной инъекции, поместите его в стереотаксический или другой аппарат для удержания головы, убедитесь, что череп хорошо закреплен. Это необходимо для поддержания стабильной записи одиночных клеток.

Далее нанесите на глаза офтальмологическую мазь для предотвращения сухости и поддержания температуры тела животного на уровне 37 градусов Цельсия, выполните дренирование грудины CI для дополнительной стабильности записи, удалите ткани из задней части черепа лезвием скальпеля, чтобы обнажить большую CI грудину. Затем сделайте небольшой зазубрин в доре кончиком лезвия, чтобы отток спинномозговой жидкости. Теперь с помощью скальпеля выполните небольшую трепанацию черепа над кортикальной областью интереса.

После этого удалите твердую мозговую оболочку, после чего покройте обнаженную кору слоем теплого ароса. Поддерживайте агрос во влажном состоянии с помощью солевого раствора. Подготовьте язычок для подставки электрода.

Приклейте электрод к стеклянной капиллярной трубке с помощью суперклея и ускорителя. Затем добавьте термоусадочную трубку для захвата. После этого установите электрод на моторизованный или гидравлический микромический манипулятор и настройте его движение ортогонально к поверхности коры головного мозга.

Проведите заземляющий провод под кожу к черепу. Избегайте контакта с мышцами на боковой стороне головы и задней части шеи, так как они могут создавать графические артефакты. Электрический сигнал усиливается с помощью внеклеточного усилителя, подходящего для записи одного устройства, предпочтительно оснащенного режимом проверки импеданса.

Текущая активность спайков контролируется с помощью двух осциллографов и набора активных динамиков. Теперь проведите электрод через агрос и проверьте его импеданс, чтобы убедиться, что он находится в пределах от 7 до 14 мегаом. Когда кончик прорвется за поверхность коры головного мозга, обнулите это положение на микром манипуляторе.

Чтобы наилучшим образом оценить глубину записи, визуально убедитесь, что кончик электрода выходит из кортикальной поверхности на нулевой глубине. При выводе электрода в конце проникновения в слуховую кору для того, чтобы убедиться, что этот нулевой заданный момент соответствует уровню коры, мониторы стимула вызывают потенциалы поля. Проталкивая электрод через первые несколько сотен микрометров ткани, убедитесь, что полярность потенциала локального поля меняется на противоположную на глубине 100 микрометров.

Затем установите оптическое волокно, связанное с синим источником света, на ручной микроманипулятор. Регулируйте выходную мощность источника света с помощью блока управления, способного выдавать последовательность импульсов TTL заданной ширины и продолжительности. Затем контролируйте сигнал на обоих осциллографах.

Измерьте общую мощность света на кончике оптического волокна с помощью измерителя мощности. Используйте это значение для расчета интенсивности излучения, разделив ее на площадь поперечного сечения сердцевины волокна. Начните со значения в диапазоне от 10 до 15 милливатт на квадратный миллиметр.

С помощью микроскопа расположите кончик волокна как можно ближе к поверхности волокна. Центрируйте луч в том месте, где электрод будет входить в ткань. Теперь проверьте наличие световых артефактов с помощью электрода в арос.

Подайте импульсную деформацию. Устраните любые переходные световые артефакты, изменив положение оптического волокна относительно электрода для изменения угла падающего света. Если артефакты не исчезают, попробуйте уменьшить мощность света.

Затем медленно продвигайте электрод через мозг со скоростью примерно один микрометр в секунду. Используйте один осциллограф для контроля текущей активности электрода. Используйте другой для запуска лазерных импульсов.

Прислушайтесь к слабому хэшу света, вызванному всплесками на аудиомониторе, которые указывают на то, что электрод приближается к каналу опсин-положительной клетки. Затем замедлите темп продвижения, как только загорится свет. Шипы достаточно велики, чтобы их можно было запускать по отдельности на осциллографе.

Начните это делать. Отрегулируйте шкалу по горизонтальной оси, чтобы наблюдать за точной формой волны спайка. На этом этапе прекратите продвигаться электрод и подождите, пока он осядет в ткани.

Это критически важно для стабильной записи. Через несколько минут, если соотношение сигнал/шум не улучшилось, продвинуться дальше на пять микрометров и подождать. Опять же, повторяйте этот процесс до тех пор, пока пик или впадина потенциала действия не будут надежно зафиксированы с помощью порога напряжения.

Установите уровень шума значительно выше минимального уровня шума во время записи. Следите за текущей активностью на первом осциллографе. При этом обратите внимание на размер и форму шипов с помощью второго осциллографа и обратите внимание на качество их звучания на динамике.

Внимательно прислушивайтесь к резким изменениям, которые указывают на то, что элемент либо слишком близко приближается к электроду, либо отдаляется. Если шипы стали большими и деформировались, извлеките электрод. Если они становятся меньше, продвиньте электрод.

Двигайтесь медленно с шагом в два микрометра, чтобы подтвердить качество шипов. Наложение всей формы волны пика в широком диапазоне пороговых значений. Должна быть видна только одна постоянная форма шипа одинаковой высоты.

Большинство PV-положительных элементов могут поддерживать возбуждение в течение целой одной секунды. Если сигнал загрязняется шипами от соседнего нейрона, продвигаем электрод и ищем новую ячейку в каждом проникновении, опускаем электрод по всей глубине коры. Если после многих проникновений не обнаруживаются светочувствительные нейроны или, наоборот, записи регулярно загрязняются шипами из соседнего канала, опсинотрицательных клеток, попробуйте новый электрод.

На этом рисунке показаны примеры записей от трех типов оптически идентифицированных интернейронов. Клетки реагируют на последовательность импульсов поиска надежным всплеском шипов. Здесь показаны 100 линейных пиков и средняя интерполированная форма волны.

Эти графики списка показывают последовательное время появления световых всплесков. Первые пиковые задержки для выборки мощности. Здесь представлены волиновые позитивные интернейроны.

Подход к фотостимуляции концептуально очень прост, но он может быть удивительно сложным и малопродуктивным. На практике. Стеклянные накладные электроды сильно смещены в сторону параметаллических нейронов, поэтому внутренние нейроны встречаются не очень часто.

С другой стороны, с помощью тетроса вы получаете множество реагирующих на свет интернейронов, но спайки маленькие, и есть много перекрывающихся форм волн, поэтому очень трудно надежно отсортировать их по отдельным единицам. Мы пытаемся сделать это разными способами, и для внутренних нейронов мы обнаружили, что эти острые электроды мощностью от 10 до 14 мега обеспечивают правильный баланс с точки зрения радиуса прослушивания, который должен быть достаточно большим, чтобы обнаруживать свет дубовых шипов на расстоянии, но достаточно ограниченным, чтобы достичь хорошей изоляции одной единицы. Хотя в этом есть доля вуду.

Если вы не сможете этого достичь, вы сэкономите себе много времени, просто отказавшись от одного электрода и перейдя к следующему, пока не найдете тот, который будет работать.