Моделирование Астроцитома Патогенез In Vitro И В Vivo Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей

Общая цель данного эксперимента заключается в создании генетически модифицированных моделей астроцитомы из определенных типов клеток для фенотипической характеристики in vitro и in vivo. Это достигается путем забора первичных клеток дикого типа у неонатальных генетически модифицированных мышей, не экспрессирующих кри, для культивирования in vitro. На втором этапе первичные клетки инфицируются аденовирусным вектором, кодирующим рекомбинацию кри, чтобы индуцировать генетическую рекомбинацию аллелей F-flox in vitro.

Затем рекомбинированные клетки последовательно культивируют для их фенотипической характеристики. В конечном счете, способствуют ли определенные мутации глиоагенезии в конкретных типах нервных клеток, определяется характеристикой опухогенных фенотипов in vitro и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейроонкологии, такие как Каковы фенотипические последствия мутаций, связанных с астроцитомой?

Применение этого метода распространяется на доклиническую разработку лекарств для лечения астроцитом, поскольку эти генетически определенные клетки могут быть использованы in vitro и in vivo у иммунокомпетентных сингенетических мышей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы забора клеток и ортотопической инъекции технически сложны и требуют точной идентификации анатомических структур. Демонстрировать процедуру будет Райан Баш, техник из моей лаборатории по забору мозговой ткани.

Начните с использования стерилизованных этанолом ножниц для препарирования, чтобы сделать сагиттальный разрез на коже черепа усыпленной новорожденной мыши, обученной генной инженерии в возрасте от одного до трех дней, от спинного мозга до носа. Далее сделайте надрез в черепной коробке вдоль сагиттального шва, начиная от спинного мозга и проходя мимо обонятельных луковиц. Затем с помощью изогнутых щипцов аккуратно отклейте каждое полушарие черепа в боковом направлении от мозга с помощью прямых микрощипцов.

Затем аккуратно отщипните дорсальную часть каждого коркового полушария, стараясь избежать мозжечка и обонятельной луковицы, и поместите мозговую ткань в чашку для культуры тканей, содержащую H-B-S-S-N. Под рассекающим микроскопом с помощью двух пар микрощипцов аккуратно удалите мозговые оболочки из каждого коркового полушария и поместите чашку для культуры тканей обратно на лед для гомогенизации мозговой ткани. Во-первых, используйте чистое лезвие бритвы, чтобы окончательно нарезать корковые полушария.

Затем переместите пластину в колпак для культуры тканей и переложите кусочки ткани в стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте тарелку одним миллилитром ледяного HBSS и переложите средство для стирки в тюбик. После удаления избытка HBSS при температуре в два миллилитра комнатной температуры трипсин с ЭДТА поступает в трубку и далее связывает фрагменты ткани путем пипетирования вверх и вниз около 10 раз с помощью пипетки объемом в один миллилитр

Инкубируйте клеточную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-20 минут. Осторожно перемешивая клеточный раствор путем инверсии каждые пять минут после инкубации, добавляя три миллилитра готовой среды в клеточную суспензию для ингибирования трипсина, пипетируя вверх и вниз 10 раз, как показано выше. Затем раскрутите диссоциированные астроциты.

Осторожно извлеките снат с помощью пипетки объемом в один миллилитр и повторно суспендируйте гранулу в четырех миллилитрах при температуре 37 градусов Цельсия. Полноценный носитель. Затем перенесите суспензию астроцитов в колбу для культуры тканей с завинчивающейся крышкой T 75 и поддерживайте кортикальные астроциты при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе примерно через 16 часов после забора.

Вымойте колбу четырьмя миллилитрами 37 градусов Цельсия HBSS. Затем добавьте четыре миллилитра полной среды и поддерживайте кортикальные астроциты на уровне 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе. Когда культура достигнет примерно 95% конфлюенции, встряхните культуру в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Затем удалите среду, содержащую оторвавшиеся клетки, и промойте пластину еще четырьмя миллилитрами 37 градусов Цельсия HBSS. Затем добавьте четыре миллилитра свежей полной среды и снова инкубируйте клетки через 24 часа после обогащения культуры кортикальными астроцитами. Освежите культуру двумя миллилитрами готовой среды.

Затем инкубируйте клетки с одним миллилитром полной среды, содержащей один микролитр не менее одного раза в 10-й части 10-го фунта на миллилитр интересующего аденовируса при 32 градусах Цельсия и 5% углекислого газа при 5 градусах Цельсия. Инфекция Gfab CRE вызывает пролиферативное преимущество в рекомбинированных астроцитах gfab, увеличивая чистоту астроцитов с 59% до более чем 90% после пяти-девяти пассажей в культуре. Через шесть часов удалите среду, содержащую вирус, и повторно инкубируйте культуру в свежей, готовой среде.

После того, как кортикальные астроциты собираются при примерно 90% слиянии и соответствующем количестве клеток, ресуспендируются в ледяной 5% метилцеллюлозе. Поместите стеклянный шприц объемом 250 микролитров в дозатор повторяющихся антигенов, а затем прикрепите к шприцу тупую иглу 18 калибра. Используйте иглу 18 калибра, чтобы аспирировать кортикальные астроциты в шприц и удалить любые пузырьки воздуха.

Затем выбросьте иглу 18 калибра и установите иглу 27 калибра на шприц. Нажимайте кнопку на дозаторе антигена до тех пор, пока жидкость не будет выброшена из новой иглы для имплантации астроцитов. Затем закрепите иммунокомпетентное животное-реципиент в возрасте от трех до шести месяцев в стереотаксической рамке и сделайте разрез над сагиттальным швом длиной примерно 0,5 сантиметра между ушами и глазами.

Найдите место пересечения коронального и сагиттального швов или BRE MA, а также пересечения лямбдоидной мышцы в сагиттальных швах или лямбда. Убедившись, что BMA и лямбда находятся в одной горизонтальной плоскости, прикрепите шприц и дозатор повторяющегося антигена к стереотаксической рамке над головой животного и приведите кончик иглы в контакт с bgma. Слегка приподнимите иглу от поверхности черепа и переместите два миллиметра в сторону и один миллиметр ростраль от bgma.

Затем опустите иглу осторожно через череп к месту назначения. На четыре миллиметра вентрально от брега МА и активировать повторяющийся дозатор антигена. За один раз ввести пять микролитров клеточной суспензии.

Оставьте иглу на месте на две минуты, чтобы внутричерепное давление уравновесилось, а затем медленно извлекайте иглу в течение 30 секунд, используя ватный тампон, чтобы надавить на любое кровотечение, которое может произойти. Наконец, используйте тканевый клей, чтобы приблизить края раны и закрыть разрез, а затем поместите животное в чистую, теплую клетку для восстановления. Ксенотрансплантаты установленных клеточных линий человека требуют иммунодефицитных хозяев и, как правило, не повторяют гистопатологию астроцитомы человека.

Например, ортотопические ксенотрансплантаты U 87 MG образуют ограниченные опухоли, которые не проникают в нормальный мозг. Напротив, инъекция T RRP нулевых астроцитов в мозг иммунно компетентных сингенных мышей приводит к образованию опухолей, которые повторяют гистологические особенности их человеческих аналогов, в частности, вторжение в нормальную ткань мозга. Для мониторинга роста нулевого аллотрансплантата TRP мышей умерщвляли каждые пять дней после инъекции клеток, а опухолевую нагрузку определяли путем количественной оценки площади опухоли на участках мозга, окрашенных h и e.

Было установлено, что площадь опухоли со временем увеличивается экспоненциально, а ортотопическая инъекция от 10 до пятой части астроцитов TP nll в мозг реципиента привела к неврологической заболеваемости. С медианой выживаемости 22 дня. Продольная визуализация in vivo использовалась для определения кинетики роста опухоли.

Таким образом, в этом эксперименте в мозг иммунно-компетентных сингенных организмов были введены штрафные астроциты TR и сконструированные для экспрессии люциферазы. Однопометников и рост опухоли определяли с помощью серийной биолюминесцентной визуализации. В течение 16 дней наблюдалось 15-кратное увеличение биолюминесценции.

После этой процедуры можно провести тестирование лекарств in vitro и in vivo для определения эффективности и тестирования новых комбинаций лекарств. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как собирать кортикальные астроциты у условно генетически модифицированных мышей без экспрессии креа, как индуцировать генетическую рекомбинацию in vitro и как моделировать опухолегенез с помощью ортотопических аллотрансплантатов у иммунокомпетентных мышей.