В режиме реального времени изображений эндотелиальных межклеточных соединений Во нейтрофилов Трансмиграция в физиологических Flow

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы проследить распределение эндогенного переходного, теринового и pcam-1 во время трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в условиях физиологического потока. Это достигается путем выделения полиморфноядерных лейкоцитов или ПМН из цельной крови здоровых добровольцев с использованием прокоградиента. Второй шаг заключается в добавлении флуоресцентно меченых антител к монослою эндотелиальных клеток эндотелиальных клеток пупочной вены человека, стимулированным ФНО альфа, культивируемым на предметных стеклах за 30 минут до начала эксперимента с потоком.

Это позволит визуализировать динамику соединений эндотелиальных клеток при трансмиграции нейтрофилов в условиях физиологического потока. Затем предметное стекло, содержащее флуоресцентно меченые эндотелиальные клетки пупочной вены человека, стимулированные TNF альфа, подключают к проточной системе и помещают на предметный столик микроскопа. Насос будет вытягивать буфер потока из резервуара через проточную камеру в шприц.

Последним шагом является медленный впрыск PMN в проточную систему через впрысковое отверстие. В конечном счете, ПМН визуализируются с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Через несколько минут появляются, прилипают и переселяются лейкоциты.

Эксперимент может быть остановлен в любой желаемый момент. Основное преимущество этой методики перед другими существующими методами, такими как статические трансмиграционные анализы, заключается в том, что с помощью этой методики можно изучать адгезию и трансмиграцию в реальной жизни в условиях физиологического течения. Это поможет нам понять, почему лейкоциты выбирают один корень вместо другого, то есть PGA против трансцеллюлярной миграции.

Мы делаем это, визуализируя клеточные соединения с помощью флуоресцентно меченных антител. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека или HU X для этого эксперимента культивируют в соответствии с инструкциями производителя на посудах, покрытых фибронектином, с использованием сред с добавлением эндотелиального роста. Терпимая. Клеточную культуру используют от четырех до восьми пассажей, когда клетки достигают 80-90% Confluence, тщательно промывают их PBS комнатной температуры при pH 7,4, а затем трипсин является клетками после трипсина и центрифугирования.

Мы суспензируем при 800 000 клеток на миллилитр с помощью среды. В эксперименте используются проточные камеры, которые были покрыты фибронектином на планшете предыдущего дня. 80 000 клеток в каждом канале проточных камер, кодируемых фибронектином, аккуратно пипетируют клеточную суспензию вверх и вниз культуры в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на следующий день.

Обновите фильтрующий материал в предметном стекле проточной камеры, осторожно наклонив предметное стекло под углом 45 градусов. Рекомендуется удалять среду только в резервуарах, а не в самом канале. Удаление среды в каналах может привести к потере и гибели эндотелиальных клеток из-за силы сопротивления среды, вызванной пипетированием.

Проверьте с помощью фазово-контрастной микроскопии, образовали ли эндотелиальные клетки монослой. Если клетки не на 100% кофлюентны, меняйте среду два раза в день до тех пор, пока они не достигнут 100% конфлюенции. Как только клетки достигнут 100% беглости, стимулируйте клетки средой, содержащей медиатор воспаления.

Стимуляция ФНО альфа в течение ночи с помощью ФНО альфа приводит к воспалительному фенотипу эндотелия IE, повышающей регуляцию молекул клеточной адгезии, таких как ICAM one и VA M1. Перед выделением полиморфноядерных лейкоцитов или ПМН. Приготовьте проточный буфер для промывки выделенных ПМН и для использования в проточном анализе до 100 мл предварительно приготовленного исходного раствора. В 100 микролитрах свежего одного моляра хлорида кальция, 2,5 миллилитров человеческого альбумина из 200 граммов на литр биржевой концентрации и 0,1 грамма глюкозы.

Отфильтруйте буфер потока с помощью фильтра 0,45 микрона. Перед выделением ПМН также готовят 10%-ный раствор цитрата тринатрия или ТНК в PBS при pH 7,4. ПМН выделяют из 20 миллилитров цельной крови, собранной в гепарине натрия у здорового добровольца.

Сначала разведите цельную кровь один к одному с 10% PBST NNC в 15-миллилитровой пробирке. Затем с помощью пипетки на самом медленном уровне осторожно пипетируйте 20 миллилитров разбавленной крови на 12,5 миллилитров коллоидного раствора в воде с плотностью 1,130 грамма на миллилитр в новой 50-миллилитровой пробирке. Пробирка, содержащая per coll, должна быть наклонена под углом 45 градусов во время добавления крови.

Осторожно поместите пробирки в центрифугу и вращайте при комнатной температуре в течение 20 минут при 800 g при низком ускорении и с отключенными тормозами после завершения центрифугирования. Удалите всю жидкость и заполните каждую пробирку ледяным буфером для лизиса эритроцитов, чтобы обвести эритроциты. Оставьте трубки на льду, время от времени переворачивая их до тех пор, пока подвеска не станет темно-красной центрифугой при 500 GS в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия с включенными тормозами.

Полученная фракция гранул содержит PMNs Вместе с эритроцитами удалите надосадочную жидкость и дважды промойте гранулу в льду. Холодный лизис буфера при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления надосадочной жидкости из второй промывки повторно суспендируйте гранулу с буфером потока при комнатной температуре и определите концентрацию PMN с помощью автоматического счетчика ячеек.

Наконец, суспендируйте PMN в буфере потока в соотношении от 10 до шести клеток на миллилитр и держите при комнатной температуре, чтобы пометить эндотелиальный переходной VA кадгерин и pcam one. Добавьте антитело pcam LOR 6 47 в разведении 1:100 и независимое от кальция антитело FE кадгерин ZI в разведении 1:50 в культуру VE, среду в проточной камере и инкубируйте при 37°С в течение 30 минут. Чтобы подготовить ПМН к анализу, поместите их на водяную баню на 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия перед введением в проточную систему.

Подсоедините трубки к пустой проточной камере и заполните теплым буфером потока, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. При настройке проточной системы. С помощью силиконовой трубки подсоедините одну сторону пустой проточной камеры к системе подачи шприцевого насоса, содержащей шприц объемом 20 миллилитров.

Поместите проточную камеру на предметный столик микроскопа. Анализ будет проводиться с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, оснащенного 63-кратным масляным объективом и климатической камерой, установленной на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Подсоедините другую сторону пустой проточной камеры к колбе резервуара, заполненной буфером потока 37 градусов Цельсия, и запустите шприцевой насос, чтобы заполнить все трубки буфером потока, насос будет вытягивать буфер потока из резервуара через проточную камеру в шприц.

Эта трубка также содержит встроенный порт для впрыска приманки, который позволяет вводить PMN с помощью иглы в ходовой эксперимент без остановки потока и создания пузырьков воздуха. Затем замените пустую проточную камеру на проточную камеру, содержащую обработанный TNF alpha VE, отщипните трубки перед отсоединением и повторным подключением их к камере, содержащей VE.To избежать пузырьков воздуха в системе, очень важно зажать и зажать трубки. При подключении предметного стекла, содержащего клетки.

Поместите проточную камеру на предметный столик микроскопа, отрегулируйте скорость потока с точностью до одного десятицентового сантиметра в квадрате в соответствии с физиологической скоростью потока в посткапиллярном es, которая составляет от одного до пяти динов на квадрат квадрата дифференциального интерференционного контраста или DIC fite LOR 6 47. Одновременно с помощью одномиллилитрового шприца медленно вводите PMN в систему потока через встроенный порт для впрыска приманки. Через несколько минут появляются лейкоциты, прилипают и переселяются, останавливают эксперимент в любой нужный момент.

Путем отсоединения трубки от проточной камеры и дозирования фиксатора в проточную камеру измеряли сопротивление монослоев эндотелия, чтобы проверить, влияют ли антитела на барьерную функцию эндотелия. Не наблюдалось никаких изменений в резистентности, когда ЖЭ могла слышать клон антитела 55 и 7 H one, или когда к клеткам добавлялся контроль изотипа. Напротив, антитела, блокирующие слух VE трески CL 75, резко снижали резистентность.

Анализ RAP не выявил изменений в восстановлении флуоресценции в присутствии или отсутствии антитела VE CADHERIN 55 7 Hone, что указывает на то, что антитело не изменяло динамику распределения VE кадгерина, VE кадгерина и pcam one во время миграции нейтрофилов трансэндотелия или TEM в режиме реального времени. На верхней панели показан нейтрофил, обведенный белым цветом, прилипающий к эндотелию и пересекающий клетку к клеточному соединению, не нарушая распределения VE-когерента и PCAM-одного. Во время диапедеза можно наблюдать местную дисперсию когерента VE и P chem one, когда нейтрофил выступает через клетку к клеточному соединению, очерченному белым цветом – нейтрофилу на вершине эндотелия.

Желтым контуром показана мембрана нейтрофилов, которая уже находится под эндотелием. После завершения диапедеза соединения смыкаются и ве когерентно и PCAM перемещаются в места диапедезиса. Границы трансмигрировавшего нейтрофила обведены желтым цветом.

После этой процедуры может быть выполнена трансэндотелиальная миграция лейкоцитов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, проникают ли лейкоциты в эндотелий с помощью bagga или трансцеллюлярного корня.