Флуоресценции изображений с Один-нм Точность (Fiona)

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как проводить флуоресцентную визуализацию с точностью до одного нанометра или эксперименты Фионы. Это достигается путем предварительной настройки необходимого оборудования и юстировки оптики для полного внутреннего отражения, флуоресценции, микроскопии или газона. Следующим шагом является иммобилизация CY 3D NA на внутренней поверхности камеры для образца и локализация отдельных молекул CY 3D NA с нанометровой точностью.

Впоследствии Фиона применяется для изучения движения одного усеченного миозина пять, мотора, помеченного квантовой точкой. В конечном счете, ступенчатый размер миозина при его движении, Acton был измерен как 36 нанометров с помощью анализа Фионы. Хотя этот метод может дать представление о молекулярных моторах, он также может быть применен к другим системам, таким как отслеживание рецепторов на мембране клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как детали эксперимента трудно изучить. Важно постоянно носить лазерные защитные очки во время настройки. Для полного внутреннего отражения, флуоресценции, микроскопии или газона.

Для начала установите высоты всех оптических компонентов на высоту центра микроскопа, заднего порта, смонтируйте лазер, лазерный затвор и нейтральные фильтры. Используйте нейтральные фильтры, чтобы снизить мощность лазера как можно ниже, сохраняя при этом видимость луча. Затяните винты соответствующими шестигранными ключами.

Запланируйте траекторию луча, как показано пунктирными синими линиями. На этой схеме отметьте путь луча лентой или маркером на оптическом столе. Поместите зеркало М1 на первом повороте под прямым углом, расположите две ирисы вдоль второго прямого участка планируемой траектории луча.

Отрегулируйте как положение, так и наклон M1 таким образом, чтобы лазер проходил через радужную оболочку поместите зеркало M два. На втором повороте под прямым углом поместите расширитель луча 10 x вдоль третьего прямого участка пути. Отрегулируйте его наклон таким образом, чтобы расширитель луча был параллелен как оптическому столу, так и запланированной траектории луча.

Следующим шагом является итеративная настройка M1 и M 2 таким образом, чтобы лазер проходил прямо через центры обеих линз, L 1 и L 2 расширителя луча. Используйте лист белой бумаги, чтобы заблокировать луч после расширителя луча, чтобы проверить профиль луча на глаз. Регулируйте до тех пор, пока профиль луча расширенной балки не станет неED.

Гауссов регулируют расстояние между L 1 и L 2 так, чтобы луч был сопоставлен с затвором. Лазер откручивает объектив микроскопа и вкручивает флуоресцентную юстировку. Мишень размещает зеркала М три и М четыре, чтобы направить расширенный луч в порт микроскопа и на дихроичное зеркало.

Внутри башни. Отрегулируйте M три, чтобы центрировать самую яркую часть луча на флуоресцентной мишени, и M четыре, чтобы сделать луч вертикальным, затворите лазер и вкрутите объектив обратно. Штраф. Настройте наклоны M 3 и M 4, чтобы оптимизировать мощность лазера и профиль луча за пределами объектива.

Установите камеру E-M-C-C-D на микроскоп и подключите камеру к компьютеру. Запустите программное обеспечение для камеры. Установите флуоресцентный образец на микроскоп.

Посмотрите на яркое флуоресцентное пятно на камере. Убедитесь, что пятно на экране не смещается по мере изменения фокуса. Поместите линзу TIR на столик для трансляции XY, Z на расстоянии от задней фокальной плоскости объектива, равного фокусному расстоянию, L три, которое составляет около 30 сантиметров.

Отрегулируйте положение L три таким образом, чтобы лазер проходил через центр линзы. Переместите L три вдоль траектории луча, чтобы отрегулировать сортировку луча. Убедитесь, что луч по-прежнему центрирован на мониторе и имеет симметричную форму.

Переместите L на три перпендикуляра траектории луча, чтобы наклонить луч от объектива. Продолжайте переводить линзу МДП таким образом, чтобы МДП был достигнут до проведения Fiona. Эксперимент по локализации и мобилизации CY 3D NA. Отдельные молекулы конструируют камеры для образцов, как подробно описано в тексте протокола.

На затвор по длинным краям наклеиваются две полоски двустороннего скотча, оставляя зазор в три-пять миллиметров в центре, а затем сверху затвора размещается очищенный покровный листок, на который показаны боковые виды камеры справа и спереди. Открытые концы камеры остаются открытыми и служат входом и выходом для иммобилизации SI 3D NA на внутренних поверхностях камеры для образца. Пипеткой внесите в камеру 10 микролитров биотина БСА.

Подождите пять минут. Промойте камеру для образцов, набрав в нее 40 микролитров T 50 BSA. Затем пипеткой введите в камеру 10 микролитров neut travain и инкубируйте в течение пяти минут.

Снова промойте камеру 40 микролитрами пипетки T 50 BSA, 20 микролитрами SI 3D NA в камеру для образцов и инкубируйте в течение пяти минут. Наконец, промойте камеру 80 микролитрами T 50 BSA. Для начала процедуры визуализации SI 3D NA отдельные молекулы под торфом М пипеткой введите 30 микролитров буфера для визуализации в камеру для образца и подождите от восьми до 10 минут.

Установите образец для визуализации на газонный микроскоп, оснащенный зеленым лазером, 100-кратным масляным иммерсионным объективом и камерой E-M-C-C-D. Установите время экспозиции и усиление ЭМ. Получите видеоролик образца на 1000 кадров.

Скомпилируйте и запустите анализ Fiona Pro for Fiona. Используйте эту программу IDL для импорта полученного изображения для ввода эффективного размера пикселя и коэффициента преобразования интенсивности в число фотонов, а также для выбора пятен для анализа Фионы. В конце программа выведет результаты подгонки с помощью 2D-гауссовских функций, а также общее количество фотонов и точность локализации, скомпилирует и запустит pH-подсчет pro.

Чтобы охарактеризовать количество фотонов, используйте эту программу DL для измерения среднего числа фотонов, испускаемых флорой. Четыре перед фотообесцвечиванием для импорта полученного изображения и ввода коэффициента преобразования интенсивности в число фотонов. Программа будет обнаруживать флуоресцентные пятна, автоматически вычислять количество фотонов в зависимости от номера кадра и выводить следы количества фотонов.

Подготовьте образец для этого эксперимента, пипетируя 20 микролитров биотинилированного BSA в концентрации один миллиграмм на миллилитр в DD H2O в камеру для образцов. Выдерживать в течение 10 минут. Промойте 30 микролитрами D ddh, двумя O пипетками по 0,5 мг на миллилитр neut travain и инкубируйте в течение двух минут.

Промойте камеру с 30 микролитрами М пяти PSA. Актон для этого эксперимента должен быть приготовлен за день до этого, как описано в тексте протокола. Разведите приготовленный f актин в 25 раз в общем объеме, актин буферизуйте до конечной концентрации около 0,004 мг на миллилитр.

Накачайте раствор актина пипеткой в камеру и подождите 10 минут. Промойте камеру 30 микролитрами буфера, разведите миозин пять А с флажками меток на 30. Сложите буфер M five до конечной концентрации 250 наномоляров.

Смешайте один микролитр разведенного миозина с одним микролитром Anti-Flag Q.Do 7 0 5. Добавьте восемь микролитров M five, чтобы заполнить до 10 микролитров, и пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать. Хорошо инкубировать 10 минут на льду.

Пипеткой введите 20 микролитров буфера для визуализации, содержащего миозин Q dot, в камеру для образца. Выдерживайте от восьми до 10 минут. Визуализируйте образец на газоне, микроскопе с экспозицией 30 миллисекунд.

Получите не менее 1000 кадров, чтобы начать анализ данных. Откройте видеофайл на изображении J и обрежьте видео вокруг движущегося места. Отслеживайте пятно на видео, чтобы сгенерировать координаты X и Y во времени в пикселях, применяя анализ Fiona к каждому кадру видео.

Преобразуйте пиксели в нанометры, как описано в тексте протокола. Рассчитайте смещение от начального положения в зависимости от времени. Проведите Т-тест на смещение, чтобы получить шаги миозиновой ходьбы.

Удалите все нулевые значения из столбца размера шага. Постройте график распределения размеров шагов с помощью origin или matlab. Подгонка гаусса к гистограмме.

На этом типичном изображении поверхности обездвижены SI 3D NA. Желтая стрелка указывает на одну молекулу SI 3D NA, функция распространения точки или PSF которой показана здесь. PSF оснащен двумерной гауссовской функцией, и также показаны подгоняемые невязки. Этот график представляет собой типичную кривую зависимости количества фотонов от числа кадров, а экспоненциальная подгонка дает среднее число фотонов примерно 1,4 умножить на 10 до шестого для измерения размера шага миозина видеофайла с хорошим сигналом к шуму одного миозина.

По мере того, как он идет, захватывается актиновая нить. Показаны три примера кадров. Применение Fiona к каждому кадру дает трассировку зависимости расстояния от времени, отмеченную красным цветом.

Алгоритм нахождения шагов на основе Т-критерия используется для извлечения отдельных шагов, и вывод накладывается белым цветом Размеры ступеней и нанометры помечаются белым цветом. Когда шаги из нескольких трасс объединяются в гистограмму, измеренные размеры шагов распределяются по Гауссу примерно на 35,8 плюс-минус 0,4 нанометра. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить эксперименты Фионы, включая настройку газонного микроскопа Для достижения наилучших результатов С помощью этих процедур важно свести к минимуму фотоповреждение пола, использование силы и эксперименты.

Не забывайте, что работа с микроскопией газона и Фионой может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения этой процедуры следует надевать такие меры предосторожности, как защитные очки.