Выделение РНК от мыши поджелудочной железы: Рибонуклеаза богатых тканей

Общая цель этой процедуры заключается в выделении РНК с высокой целостностью из поджелудочной железы мыши. Это достигается путем быстрого извлечения поджелудочной железы из тушки усыпленной мыши. Далее поджелудочная железа погружается в реагент для лизиса, и ткань гомогенизируется.

После центрифугирования РНК выделяют из надосадочной жидкости с использованием стандартных протоколов и добавляют раствор ингибитора РНК в конечный раствор РНК. Заключительным этапом является тщательная очистка лопастей гомогенизатора, удалив все кусочки ткани, попавшие в лезвия, а затем выполнив серию промывок этанолом и водой. В конечном счете, эта процедура позволяет выделить РНК для поджелудочной железы мыши с числом целостности РНК больше семи, что можно использовать для рутинного анализа экспрессии генов.

Меня зовут Том Шмид, и я работаю с РНК уже более 20 лет, и за все это время я не испытал ничего более сложного, чем выделение РНК с высокой целостностью для поджелудочной железы мыши. Методика, которую мы собираемся вам показать, была разработана для поджелудочной железы мыши, но на самом деле нет причин, по которым она не может быть использована для различных других тканей, включая ткани человеческих клеток, клеточные линии или другие ткани мыши, включая богатые нуклеазами ребра ткани, такие как селезенка. Использование предложений в этом протоколе позволит вам изолировать РНК с высокой целостностью из поджелудочной железы мыши.

Это может быть использовано для многих последующих приложений, таких как QPCR, матрицы экспрессии генов или RNA-Seq. Ола Эльгамаль. Старший аспирант в моей лаборатории будет демонстрировать эту технику после усыпления мыши, как описано в текстовом протоколе.

Закрепите тушу, проткнув каждое из животных четырьмя лапами в плоскую поверхность с помощью игл для подкожных инъекций 25 калибра с использованием стерильных хирургических инструментов. Разрежьте среднюю часть мыши и быстро удалите поджелудочную железу из мыши. С помощью щипцов удерживайте поджелудочную железу и отрежьте ее от селезенки и тонкой кишки с помощью пружинных ножниц.

Будьте осторожны, чтобы не растянуть поджелудочную железу во время извлечения из мыши. Нарушение ткани может привести к высвобождению рибонуклеазы. Поместите всю поджелудочную железу в трубку объемом 50 кубических сантиметров, содержащую восемь миллилитров ледяного лизисного реагента.

Закройте пробирку крышкой и кратковременно встряхните, чтобы погрузить ткань в реагент и сразу же приступайте к следующему этапу без промедления. Далее гомогенизируйте поджелудочную железу в течение пяти секунд. Важно прижать лопасти гомогенизатора к нижней части трубки центрифуги, чтобы ткань могла втягиваться в лопасти для эффективной гомогенизации.

Для удаления непереваренной ткани перенесите два миллилитра лизисного реагента, содержащего лизированную поджелудочную железу, в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Соберите две микроцентрифужные пробирки с гомогенатом на одну изоляционную центрифугу при температуре четыре градуса Цельсия, 12 000 раз по G в течение пяти минут, чтобы измельчить непереваренную ткань. Это критически важный шаг, так как перенос непереваренной ткани в последующие растворы РНК, скорее всего, загрязнит образец рибонуклеазой.

Очистите лопасти гомогенизатора, поместив их в 10 миллилитров 70% этанола. Активируйте гомогенизатор примерно на 20 секунд, чтобы удалить любые куски ткани, которые могут попасть в лезвия. Затем с помощью наконечника для дозатора объемом 200 микролитров удалите все части, оставшиеся в лопастях гомогенизатора.

Снова очистите лопасти гомогенизатора в воде с помощью общего активатора РНК и 70% этанола. Наконец, высушите вал гомогенизатора чистой салфеткой Кима. Перелейте один миллилитр SNA в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.

Поместите все пробирки, содержащие гомогенат, на влажный лед, переходя к следующему этапу. Немедленно приступайте к выделению РНК и храните пробирку репликата при температуре минус 80 градусов Цельсия для использования в будущем. Слейте оставшийся реагент для лизиса в соответствующий контейнер для химических отходов.

В следующем разделе используется набор для очистки РНК. Преимущество набора для очистки заключается в том, что он изолирует общую РНК, в том числе малые РНК. Начните изоляцию с добавления в раствор гомогената 200 микролитров хлороформа.

Закройте тюбик крышкой и энергично встряхивайте рукой в течение 15 секунд. Затем дайте пробирке постоять при комнатной температуре в течение двух-трех минут после центрифугирования в течение 15 минут при температуре 12 000 раз G и четырех градусах Цельсия. Перенесите верхний водный слой в микроцентрифужную пробирку.

Добавьте 1,5 объема изопропанола и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Перелейте до 700 микролитров образца в спиновую колонку, которая помещается в двухмиллилитровую пробирку для сбора. Закройте крышку и центрифугируйте при температуре 8 000 раз G в течение 15 секунд при комнатной температуре, а затем сбросьте поток.

Далее добавьте 700 микролитров буферного RWT в спиновую колонку и центрифугу. Как и раньше, сбросить поток через пипетку 500 микролитров буферного РПЭ в спиновую колонну и снова центрифугировать для промывки колонки. После отбрасывания сквозного потока добавьте еще 500 микролитров буферного РПЭ в центрифугу для спиновой колонны на две минуты в 8 000 раз G.To сушки колонки, перенесите спиновую колонку в микроцентрифужную трубку пипетки объемом 1,5 миллилитра, 100 микролитров воды без ядра ребра непосредственно на мембранную центрифугу для спиновой колонны на одну минуту в 8 минут, 000 раз G для элюирования, РНК.

Затем добавьте один микролитр ингибитора РНК в раствор РНК и приступайте к определению целостности РНК с помощью анализа капиллярного электрофореза, как описано в текстовом протоколе: сравнение числа целостности РНК или RIN РНК, выделенных из поджелудочной железы мыши, выявило прямую корреляцию между объемом лизисисного реагента, используемого при гомогенизации, и целостностью РНК. Результаты указывают на то, что следует использовать восемь миллилитров лизисного реагента В этом протоколе ингибитор рибонуклеазы добавляли в водный раствор РНК и сравнивали целостность РНК при замораживании. РИН для раствора РНК с ингибитором составил 7,3 плюс-минус 0,15 по сравнению с 2,9 плюс-минус 0,65 для раствора, который не содержал ингибитор, чтобы изучить возможность того, что повторное замораживание приведет к денатурации ингибитора рибонуклеазы, что сделает его неэффективным.

Был протестирован раствор РНК, содержащий ингибитор рибонуклеазы. Растворы РНК, которые были заморожены и разморожены до пяти раз, по-прежнему давали RIN 7 или выше. В то время как растворы, которые были заморожены и разморожены шесть раз или выше, имели RIN ниже семи случайных простых чисел, CDNA синтезировалась из РНК, и экспрессия трех генов хозяйствования измерялась с помощью QPCR.

Используя стандартные методы, данные подтверждают успешное использование РНК поджелудочной железы мыши в стандартном методе молекулярной биологии. После надлежащей подготовки аспиранты и постдоки должны быть в состоянии освоить эту технику примерно за 30 минут. И я просто хочу рассказать вам немного о том, как мы его используем.

Мы изучаем трансгенные мышиные модели рака поджелудочной железы и используем эту технику для выделения РНК. И затем, когда мы получим РНК, мы будем изучать экспрессию генов микроРНК у этих животных.