Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из Дрозофилы

Общая цель этой процедуры заключается в препарировании имагинальных дисков у личинок дрозофил Для иммуногистохимии это достигается путем удаления головного комплекса, состоящего из рта, крючков, глазных и тенальных дисков, а также мозга у личинок. Второй шаг – фиксация головного комплекса и его инкубация с первичными и вторичными антителами. Далее глазные и тенальные диски отделяются от головного комплекса.

Заключительным этапом является установка имагинальных дисков в антиотбеливающем средстве на предметное стекло. В конечном счете, флуоресцентные репортеры или репортеры LAC Z и окрашивание антителами могут выявить пространственную и временную экспрессию генов и белков в имагинальных тканях с помощью флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, этот метод может быть использован для получения информации о локализации генов и белков в энтен-имагинальном диске.

Его также можно наносить на другие имагинальные ткани, такие как крыло, нога и остановка. Здесь. Чтобы начать эксперимент, заполните 35-миллиметровую чашку Петри буфером для препарирования. Поместите от 10 до 20 личинок в чашку Петри и дайте им поплавать в течение пяти минут.

Для самоочистки от вредителей пипетка создает одну большую ванну буфера для рассечения в середине пластины на основе силикона. Разместите три меньших бассейна вокруг большого бассейна и с помощью щипцов перенесите личинок в донный бассейн. Далее, используя щипцы номер пять, перенесите одну очищенную личинку из малого бассейна в большой бассейн буфера для вскрытия.

Чтобы начать грубое вскрытие, используйте одну пару щипцов, чтобы захватить крючки для рта, а другую пару щипцов, чтобы аккуратно захватить личинок. На одной трети длина его тела удерживает крючок для рта неподвижно. Быстро оттяните остальную часть тела с помощью второй пары щипцов.

Освободите личинку от щипцов и дайте кишкам выплеснуться, что позволит имагинальным дискам оставаться в их нормальном состоянии. Затем возьмитесь за крючки для рта и с помощью другой пары щипцов удалите нижние две трети личинок, включая внутренние кишки. Далее аккуратно удалите слюнные железы, диски ног и другие ткани.

Единственные ткани, которые должны остаться – это небольшое количество вышележащей кутикулы. Ротовые крючки, глазные и тенальные диски, полушария мозга и вентральный ганглий. Максимум через 20 минут перенесите все рассеченные ткани в параформу альдегида лизинового пария.

Фиксатор даты или PLP. Не позволяйте имагинальным дискам оставаться в буфере для рассечения дольше 20 минут, иначе после диссекции они будут деградировать. Переложите рассеченные ткани с шагом 100 микролитров на стекло часов с холодным PLP.

С помощью щипцов убедитесь, что рассеченные ткани полностью погружены в воду. Инкубировать рассеченные ткани в холодном фиксаторе PLP в течение 45 минут при комнатной температуре без перемешивания. Далее переведите 100 микролитров рассеченных тканей из PLP в буфер для промывки.

Убедитесь, что ткани полностью погружены в воду, и инкубируйте их при комнатной температуре без перемешивания в течение 45 минут. Затем перенесите рассеченные ткани в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. Снимите буфер для стирки и замените его 100 микролитрами блокирующего раствора.

Инкубируйте ткани при комнатной температуре с осторожным вращением на настольном ротаторе в течение 10 минут. После блокировки удалите раствор и замените его 100 микролитрами раствора первичного антитела в 10%-ной обычной козьей сыворотке. Инкубируйте ткани при комнатной температуре с мягким вращением в течение 16 часов в зависимости от силы антитела.

Далее удалите первичное антитело и замените его 750 микролитрами буфера для промывки. Поместите пробирку на мутатор при комнатной температуре на 10 минут. Извлеките трубку из мутатора и дайте головкам осесть на дно трубки.

Затем снимите буфер для промывки и добавьте 100 микролитров раствора вторичного антитела в 10% сыворотки от нормы. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре с осторожным вращением не менее двух часов в зависимости от силы антитела. После инкубации удалите вторичный раствор антитела из ткани.

Замените его 500 микролитрами буфера для промывки и дайте салфетке осесть на дно трубки. Поместите три лужи промывочного буфера на силиконовую препарирующую пластину. Перенесите все рассеченные ткани в большую ванну буфера для мытья, которая была размещена на чашке для препарирования.

Это помогает удалить излишки вторичных антител, начать тонкое рассечение, расположить головку сложной вентральной стороной вниз и обхватить кутикулу за ротовые крючки. Поместите вторую пару щипцов в пространство между мозгом и глазными дисками и быстро оттяните мозг от крючков для рта, чтобы удалить две доли мозга, продолжая держаться за крючки для рта. Отщипните ткань как можно ближе к месту соединения антенной части диска антенны глаза и крючка для рта.

Продолжайте до тех пор, пока не будет рассечена вся необходимая ткань. Затем добавьте два небольших листа папиросной бумаги размером с крышку на расстоянии трех дюймов друг от друга на тарелку для препарирования. Поместите на эти листы бумаги предметное стекло, чтобы предметное стекло не прилипло к силиконовой основе чашки для препарирования.

С помощью пипетки P 20 мужчинам добавьте девять микролитров антиотбеливающего средства в середину стекла предметного стекла микроскопа, чтобы предотвратить обесцвечивание ткани флуоресцентным светом, с тем же неразрезанным наконечником, соберите все I и тенальные диски и добавьте их в каплю антиотбеливающего реагента. Затем с помощью щипцов отделите и распределите глазные и тенальные диски в капле антиотбеливающего реагента до тех пор, пока имагинальные диски не соприкоснутся. С помощью тонкой малярной кисти аккуратно опустите покровный лист на каплю антиотбеливающего средства, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.

Наконец, храните предметные стекла при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к просмотру и визуализации ионных тенальных дисков с помощью световой или флуоресцентной микроскопии. Этот метод надежно позволяет получить высококачественный материал для анализа, который передается с помощью этих конфокальных изображений имагинальных дисков. Диски были обработаны фоидом и конъюгированным флюоро-4, который связывается с f-актином и, следовательно, очерчивает каждую клетку.

Одной из наиболее поразительных особенностей локального диска является морфогенетическая борозда, которую можно увидеть как углубление в ткани, проходящее вдоль дорсальной вентральной оси. По мере того, как борозда продвигается по полю глаза, море неупорядоченных клеток преобразуется в упорядоченный массив периодически расположенных единичных глаз или Oma Tedia. Верификация клональной экспрессии и анализ I-образного диска возможны при последующем применении этого метода.

На трех верхних панелях отображаются диски, которые были окрашены различными антителами, такими как ILIS, A DPP, LAC Z транскрипционный репортер, и клеточно-специфическими маркерами, такими как эмбриональный, летальный, аномальное зрение или vy, который кодирует паннейрональный РНК-связывающий белок. На трех нижних панелях изображены диски, в которых GFP используется для обозначения популяций клеток. После освоения курса выделение головных комплексов от 10 до 20 личинок займет примерно 10 минут, а кроме того, тонкое выделение ионного тенального диска из этих комплексов также займет около 10 минут.