3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

Общая цель этой процедуры — проиллюстрировать, как отслеживать быстро движущиеся органеллы, такие как лизосомы, движущиеся в 3D внутри живой клетки. Это достигается путем предварительного окрашивания лизосом и микротрубочек с использованием специальных коммерческих красителей внутри культивируемых живых клеток. Второй шаг заключается в использовании лазерного сканирующего микроскопа и использовании метода слежения за орбитой для отслеживания движения лизосом с высокой скоростью, размер орбиты и другие параметры, такие как частотная характеристика системы, затем выбираются для проведения экспериментов по отслеживанию.

В конечном счете, результаты показывают, что можно следить за быстро движущимися лизосомами в трех измерениях и обнаруживать взаимодействия с другими флуоресцентно окрашенными органеллами, встречающимися вдоль лазерной орбиты во время отслеживания. Основные преимущества метода 3D трекинга перед другими существующими методами, которые основаны, например, на астигматах, заключается в том, что метод 3D трекинга позволяет отслеживать в очень большом диапазоне деменцию. Этот метод может помочь задать ключевой вопрос в области везикулярного транспорта, например, как везикулы движутся по микротрубкам.

Хотя этот метод может быть использован для изучения эндосомальной динамики. Он также может быть использован в других системах, где возможно флуоресцентное мечение изолированных частиц, таких как наночастицы Go, мембранные рецепторы, агрегированные ядерные порт-комплексы или генетические локусы, поддерживаемые клетки яичников китайского хомяка или CH K one, как описано в текстовом протоколе. После сбора ячеек поместите их на 14 миллиметров в диаметре.

Микролунка с толщиной поверхности 0,16 миллиметра Затравочные клетки для оптимальной плотности для визуализации от 60 до 70% текучести CO инкубируют клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия 5% CO2 на следующий день, трижды промывают клетки в буферном физиологическом растворе Хэнка или используется H-B-S-S-H-B-S-S для удаления мертвых клеток или мусора с культурального планшета и подготовки клеток к этапу окрашивания. Затем инкубируйте клетки в растворе HBSS, содержащем концентрацию 50 аномоляров лио трекера и 150 ано моляра тубулина трекера зеленого цвета в течение одного часа при 37 градусах Цельсия после инкубации. Промойте ячейки три раза в HBSS, чтобы удалить несвязанный краситель.

Добавьте свежую среду для выращивания DMEM перед визуализацией клеток. Микроскоп для отслеживания частиц, описанный в видеопротоколе, собран на раме коммерчески доступного инвертированного микроскопа. Используется когерентный хамелеон ультра два титановых сапфировых фемтосекундных лазерного возбуждающего источника света с настраиваемым выходным диапазоном длин волн от 690 нанометров до 1040 нанометров.

Убедитесь, что лазерный луч выровнен в заднем порту микроскопа. С помощью зеркал с инфракрасным покрытием лазерный луч ослабляется с помощью вращающейся полуволновой пластины, помещенной перед кальцитовым поляризатором, ослабляют луч так, чтобы средняя мощность образца составляла от 0,5 до двух милливатт. Соберите флуоресцентный свет из образца, поместив водяной объектив с высокой числовой апертурой в световой путь.

Затем поместите образец на моторизованный предметный столик и отрегулируйте точное движение объектива микроскопа. Использование объективного пизоконтроллера. Выберите куб флуоресцентного фильтра в соответствии с желаемой длиной волны излучения в одно- или двухканальной конфигурации.

Используйте фильтры с полосой излучения. Для дальнейшего выбора спектрального диапазона излучаемой флуоресценции направляйте свет из куба фильтра в фотоумножители, где сигнал усиливается и дискриминируется и направляется на цифровую плату сбора входных данных для получения изображения клеток, позиционирования их на сцене и фокусировки с помощью проходящего светового освещения. Переключитесь на растровую визуализацию, чтобы идентифицировать клетки, которые включили краситель, а чтобы визуализировать нижележащие микротрубочки, определить начальную область, где присутствует движение везикул.

После того, как изолированный везикул идентифицирован, установите параметры для отслеживания орбиты. Во-первых, выберите радиус орбиты, чтобы определить размер кругового сканирования в соответствии с размером отслеживаемой частицы. Для точечного излучателя установите радиус орбиты, равный талии функции распространения точки или PSF луча возбуждения.

Для максимальной чувствительности и отклика. Задайте осевое расстояние, чтобы определить расстояние между двумя орбитами, которые выполняются для локализации положения частицы в осевом направлении. Установите осевое расстояние от 1,5 до трех раз больше потерь PSF.

Определите время задержки в соответствии с яркостью частицы, чтобы установить время, проведенное на каждой точке орбиты, что также определит скорость обесцвечивания фотографий. Используйте время выдержки от 10 до 100 микросекунд. Установите количество точек на каждой орбите равным 64 или 128, чтобы получить периоды орбит порядка от четырех до 32 миллисекунд и обеспечить высокое временное разрешение для определения положения частицы.

Измените сигнал смещения постоянного тока, отправляемый на зеркала, чтобы центрировать луч на частице через графический интерфейс пользователя с помощью выбора курсора на растровом отсканированном изображении. Начните отслеживание, переключив режим микроскопа с растрового изображения на орбитальное сканирование. Активируйте обратную связь и сбор данных для анализа траектории.

Используйте программное обеспечение для отображения флуоресценции, собранной в каждой точке вдоль орбиты и в каждой временной точке в виде ковра интенсивности. Интенсивность, собранная вдоль ковра, дает информацию о взаимодействии частицы с другими яркими объектами. Отображайте как информацию о траектории, так и интенсивность флуоресценции, собранную с фотоумножителя с течением времени, в виде временных рядов.

Используйте представление временных рядов и информацию о ковре интенсивности, чтобы выбрать только интересующую область траектории. Затем отобразите 2D-проекцию выбранного участка траектории частицы. Выберите соответствующие элементы управления для цветовой кодировки траектории в соответствии с интенсивностью флуоресценции частиц.

Выберите опцию отображения траектории частицы в 3D и закодируйте ее цветом в соответствии с интенсивностью флуоресценции. Вращайте траекторию в 3D с помощью элементов управления, чтобы визуализировать особенности движения лизосом вдоль микротрубочки. С помощью флуоресцентного зеленого окрашивания лизосом и микротрубочек с помощью флуоресцентного зеленого красителя можно получить изображение высокоскоростного движения везикул вдоль микротрубочек с помощью двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа.

Тем не менее, растровая визуализация не имеет временного разрешения, необходимого для точного отслеживания движения более быстрых эндосом, если используется орбитальное слежение. Вместо этого данные показывают, что можно получить траектории смещения x, y, z с временным разрешением 32 миллисекунды. В этих траекториях смещения во времени анализ ковра отображает интенсивность, зарегистрированную вдоль каждой орбиты.

Со временем траектория интенсивности предоставляет информацию о флуоресцентном окружении частицы. Квадратная область соответствует участку траектории между двумя прыжками. Яркие пятна за пределами прямоугольной области соответствуют взаимодействию частицы с другими яркими объектами и связаны со скачками траектории, поскольку орбиты перецентрируются на самом ярком флуоресцентном источнике.

Во время слежения может быть зарегистрирована интегральная интенсивность излучаемой флуоресценции. Реконструированная 3D-траектория демонстрирует направленное движение, как и можно ожидать от везикулы, движущейся по сети микротрубочек. Кроме того, можно соотнести 3D-траекторию с РА или сканированным изображением окружающей области.

Это подтверждает движение частицы в направлении пучка микротрубочек. После освоения этой техники ее можно выполнить за несколько часов, если она правильно выполнена во время попытки. В этой процедуре важно помнить о том, что необходимо использовать уровень мощности лазера, который не вреден для вашего образца, при использовании фотонного цитирования, как показано в этом протоколе, уровни мощности около двух милливольт после объективов должны поддерживаться.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться очень хорошее понимание того, как организовать эксперимент с использованием метода 3D орбитального слежения, который позволяет отслеживать объекты очень большого диапазона Z.