Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за влиянием событий гибридизации ДНК на спектры импеданса с помощью микрофлюидного электрохимического устройства. Для этого изготавливается электрохимический чип, позволяющий подключать массив электродных датчиков, а также микрофлюидный чип PDMS. Чтобы облегчить введение образцов микрообъема, два чипа соединяются вместе и функционализируются с помощью одноцепочечных зондов ДНК.

Затем одноцепочечная ДНК-мишень добавляется при гибридизации ДНК, более сильная сила отталкивания между отрицательно заряженной двухцепочечной ДНК и отрицательно заряженными молекулами цианида цианида Ферриса приводит к более высокому сопротивлению переносу заряда. В конечном счете, события гибридизации ДНК могут быть обнаружены путем измерения изменений спектров электрохимического импеданса. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование планшетного ридера или анализа J-сдвига, заключается в том, что устройства могут выполнять ту же технику с небольшим объемом образца и с меньшими затратами, не жертвуя при этом чувствительностью или специфичностью.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях рака, выявлении гриппа и генной инженерии, обеспечивая быстрый скрининг специфических последовательностей ДНК и исследование бинарной кинетики одноцепочечных последовательностей ДНК. Поскольку этот быстрый высокопроизводительный метод анализа ДНК-гибридизации может работать с небольшим объемом образца и без сложных этапов подготовки образцов, применение этого метода распространяется на нашу диагностику генетических нарушений, различных форм рака или заболеваний со специфическими маркерами ДНК, таких как грипп. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что разработка микроустройств требует контроля параметров обработки и итеративного подхода к решению таких проблем, как утечка раствора.

Чтобы нанести золотые электроды на электрохимический чип, возьмите пинцетом заготовку четырехдюймовой кремниевой пластины высшего качества и используйте промывочную бутылку, чтобы промыть поверхность обеих сторон пластины ацетоном, метанолом, а затем изопропанолом. В дальнейшем этот процесс обозначается как очистка A MI под потоком деионизированной воды. Промойте изопропанол из пластины, затем используйте азотный пистолет, чтобы высушить пластину.

Загрузите пластину в оборудование для плазменного химического осаждения из газовой фазы или оборудование P-E-C-V-D. Введите параметры, чтобы получить слой диоксида кремния толщиной в один микрометр, и запустите автоматизированный процесс, используя инструмент для распыления постоянного тока, нанесите слой хрома толщиной 200 ангстрем на пластину, затем нанесите слой золота толщиной 2000 строп. Загрузите на спиннер, обеспылите поверхность азотным пистолетом и с помощью пипетки для пастера нанесите отжим PR на один позитивный фоторезист для создания однородной пленки толщиной около 1,6 мкм.

Затем предварительно выпекайте в течение одной минуты при температуре 100 градусов Цельсия на горячей плите. Загрузите пластину с фоторезистом в юстировочное оборудование маски. Затем инициируйте экспозицию 190 миллиджоулей на квадратный сантиметр при 405 нанометрах, в которой юстировщик маски откроет затвор и подвергнет фоторезист воздействию света через маску с разработанными функциями.

После экспонирования погрузите в стеклянную посуду, содержащую 3 5 2 проявителя, и выдерживайте в течение 30 секунд, осторожно встряхивая. Затем промойте под струей воды di и высушите азотным пистолетом, как и раньше. Далее погрузите в стеклянную посуду с раствором для травления золота и выдержите в течение 1,5 минут, слегка встряхивая.

Затем переложите в стеклянную чашку, содержащую упомянутый хром, и инкубируйте, осторожно встряхивая, пока следы хрома на пластине не исчезнут. Это должно занять около 30 секунд. Промойте водой и высушите азотным пистолетом, держа пластину пинцетом.

Снимите фоторезист с помощью процедуры MI clean. Затем промойте деионизированной водой и высушите азотным пистолетом в двух слоях перчаток. Погрузите в тефлоновую посуду с чистым раствором пираньи на одну минуту.

Затем промойте водой di и обсушите азотным пистолетом. Далее, чтобы выкроить платиновые электроды, насадите пластину на спиннер. Обеспылить поверхность с помощью азотного пистолета и с помощью пастеровой пипетки дозировать PR два позитивных фоторезиста на поверхности отжима для создания равномерной пленки толщиной около 1,4 микрометра.

Поместите на горячую плиту при температуре 100 градусов Цельсия и предварительно выпекайте одну минуту. После предварительного выпекания экспонируйте пластину с температурой 30 миллиджоулей на квадратный сантиметр 405 нанометров через фотомаску. Затем поместите на горячую плиту при температуре 125 градусов Цельсия и выпекайте 45 секунд.

Снимите маску с маски, выровняйте и затопитьте. Экспонируйте пластину с выдержкой 1000 миллиджоулей на квадратный сантиметр на длине волны 405 нанометров без фотомаски. После экспонирования проявите пластину, погрузив ее в стеклянную чашку, содержащую раствор проявителя Z 400 K в соотношении шесть к одному.

Выдерживать в течение двух минут с легким встряхиванием. Затем промойте водой di и обсушите азотным пистолетом. С помощью электронно-лучевой испарительной системы наносится слой титана толщиной 400 ангстрем, а затем слой платины толщиной 1600 ангстрем на пластину.

Поместите в стеклянную посуду, наполненную ацетоном, и поместите чашку в ультразвуковую ванну на пять минут, чтобы снять фотографию. Затем не выдерживайте удержания пинцетом. С помощью бутылки для мытья промойте обе поверхности ацетоном, а затем изопропанолом.

Промойте водой di и высушите с помощью азотного пистолета. Чтобы подготовить форму для пробирных каналов, промойте чистую четырехдюймовую силиконовую пластину тестового качества с помощью процедуры MI clean. Как и раньше, изопропанол смыть с водой с последующей сушкой азотным пистолетом.

Загрузите на спиннер, присыпьте поверхность пластины азотным пистолетом и с помощью пасти-пипетки нанесите PR три негатива фоторезиста на поверхность, чтобы создать однородную пленку толщиной около 100 микрометров. Поместите на горячую плиту, чтобы предварительно выпечь ее, используя двухэтапную процедуру выпечки. Во-первых, увеличьте температуру с комнатной до 65 градусов по Цельсию на 300 градусов Цельсия в час.

Затем подержите при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут. Нагрейте до 95 градусов Цельсия при 300 градусах Цельсия в час, а затем держите в течение 30 минут. Экспонируйте пластину с силой 2 500 миллиджоулей на квадратный сантиметр на длине волны 405 нанометров с помощью фотошаблона.

Затем поместите на горячую плиту и выпекайте, увеличив температуру от комнатной до 95 градусов Цельсия при 300 градусах Цельсия в час. Подержите при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Погрузите пластину в стеклянную чашку, содержащую пропиленгликоль, ацетат монометилового эфира или проявитель P-G-M-E-A, и дайте ей проявиться в течение 10 минут.

Промойте пластину изопропанолом и высушите азотным пистолетом, чтобы изготовить каналы для анализа, чтобы найти оболочку вокруг формовочной пластины с алюминиевой фольгой, и медленно вылейте неотвержденный полидиметилсубоксан или PDMS на форму. Выпекайте форму с помощью PDMS в коробчатой печи, используя двухступенчатую процедуру выпечки, при которой температура повышается с комнатной температуры до 80 градусов Цельсия в течение пяти минут и остается на уровне 80 градусов Цельсия в течение 17 минут. После того как форма остынет, снимите PDMS с формы и поместите на алюминиевую фольгу.

Разрежьте чипы для анализа хирургическим ножом и определите отверстия с помощью инструмента для пробивки биопсии, как показано здесь. Вручную совместите каналы анализа PDMS с рабочими электродами на электрохимическом чипе. PDMS хорошо прилипает к электрохимическому чипу, герметизируя каналы и предотвращая утечку.

Подсоедините гибкую трубку к пластиковому колену или прямому соединителю, используя короткую гибкую трубку в качестве адаптера для функционализации вертикальных микроканалов. Подсоедините шприц, содержащий одноцепочечный зонд ДНК, к трубке и поместите его в шприцевой насос. Прикрепите разъемы к каждому из цельных перфорированных входов в устройстве.

Самым сложным аспектом этой процедуры является протекание раствора по микроканалам без образования пузырьков. Чтобы добиться равномерного заполнения канала, запустите насос со скоростью потока 200 микролитров в час, чтобы медленно заполнить каждый из трех отдельных микроканалов различным раствором для инкубации одноцепочечного зонда ДНК. После инкубации в течение одного часа замените трубку шприца и соединитель для промывки микроканалов с PBS Затем замените трубку шприца и соединители для заполнения микроканала раствором, состоящим из одного миллимляра шести мер, CAPTO, одного H, этанола MCH в 10 миллимолярах PBS, 100 миллимолярного хлорида натрия, и 1,395 миллимоляра TCEP, инкубируйте в течение одного часа.

Затем промойте PBS, как и перед этим с помощью пинцета. Оторвите PDMS, поверните его на 90 градусов в горизонтальное положение и установите вниз. При этом будут открыты отдельные ряды реакционных камер, каждый из которых будет содержать уникальный счетчик и электрод сравнения для анализа гибридизации ДНК.

Замените шприц, трубки и соединители для заполнения микроканалов контрольным измерительным раствором Форекс концентрированный физиологический цитрат натрия SSC буфер инкубируйте в течение 20 минут после инкубации замените шприц для заполнения микроканалов пятью миллимолярами цианида ферриса пятью миллимолярами цианида Pharaoh в растворе PBS. Затем для регистрации значений фонового импеданса электрохимической системы для различных частот с помощью электрохимической импедансной спектроскопии или ЭИС необходимо подключить потенциальную статическую связь к рабочему счетчику и электродам сравнения с помощью наконечников зонда. Введите параметры измерения EIS в компьютерное программное обеспечение, а затем начните измерение.

Повторите это измерение для каждого рабочего электрода в микроканалах, чтобы измерить гибридизацию ДНК для каждого некомплементарного и комплементарного обмена одноцепочечной мишенью ДНК. Трубка шприца и соединитель. Заполните микроканалы четырьмя концентрированными буферами SSC, содержащими один микромоляр целевой одноцепочечной ДНК, и инкубируйте в течение 20 минут.

Проводите измерения, инициируя измерение ЭИС с помощью программного обеспечения на компьютере для каждого целевого одноцепочечного раствора ДНК для проверки электрохимической активности биочипа циклического объема. Телеметрические измерения проводились в микроканалах, заполненных электроактивным окислительно-восстановительным цианидом. Одинаковая форма, высота пиков и расстояние между пиками для всех электродов демонстрируют высокую воспроизводимость, чтобы продемонстрировать способность биочипов обнаруживать события гибридизации ДНК.

Для гибридизации между тремя одноцепочечными ДНК-зондами и их комплементарными и некомплементарными одноцепочечными ДНК-мишенями наблюдались более высокие изменения сопротивления переносу заряда при введении комплементарной одноцепочечной ДНК-мишени и ее гибридизации с зондом по сравнению с введением некомплементарных одноцепочечных ДНК-мишеней для демонстрации чувствительности биосенсора. Различные концентрации комплементарной одноцепочечной мишени ДНК были введены в сенсорный зонд, показанный здесь представляет собой график Найквиста измерений электрохимической импедансной спектроскопии после введения возрастающих концентраций одноцепочечной ДНК-мишени, обозначенных стрелкой на графике. Повышенные значения импеданса наблюдались на низких частотах около 15 герц для более высоких концентраций одноцепочечной ДНК из-за более сильных сил отталкивания между двухцепочечной ДНК и молекулами цианида ферроцианида ферриса.

В целом, биочипы демонстрируют способность быстро обнаруживать наличие событий гибридизации ДНК. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать и изготовить микрофлюидное электрохимическое устройство и использовать его для обнаружения событий гибридизации ДНК. При попытке выполнения этой процедуры важно помнить об оптимизации различных параметров BIOS, таких как соотношение сигнала и медсестры, стабильность и чувствительность после этой процедуры.

Другие методы, такие как введение одноцепочечных мишеней ДНК с несколько отличающимися последовательностями нуклеиновых кислот, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как комбинация мутаций ДНК и конкуренция. Не забывайте, что работа с технологическими решениями для микропроизводства может быть чрезвычайно опасной, и защита тела, глаз и рук всегда должна предупреждать при выполнении этой процедуры.