В Vivo микроинъекции и электропорации мыши яичка

В этой статье описывается микроинъекции и электропорации мыши яичка в естественных условиях, как техника трансфекции для яичек мышиных клеток для изучения уникальных процессы сперматогенеза. Представленный протокол включает этапы подготовки стеклянной капиллярной, микроинъекции через выводного протока, и трансфекции путем электропорации.

Целью данной процедуры является проведение микроинъекции генетических конструкций в яичко мыши с последующей электропорацией InVivo. Это позволяет провести комплексный анализ генов с акцентом на сперматогенез и функцию яичек. Это достигается путем получения доступа к яичку через разрез на брюшной полости непосредственно над железами PrepU.

Вторым этапом является подготовка прикрепленного к яичку эфферентного протока к микроинъекции путем освобождения сосуда от его жировой ткани. Далее ЛОР-проток прокалывают нагруженной микроинъекционной пипеткой, а раствор генетического конструкта окрашивания вводят в яичковые ферзистые канальцы. Завершающим этапом является многосторонняя электропорационная трансфекция яичка.

В конечном итоге, трансфицированное яичко извлекается через три дня для оценки трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии или люминометических измерений в зависимости от используемых генных конструкций. Эта комбинация микроинъекционной техники операции интеллекта для мышиных яичек в качестве транзиторного метода трансфекции, безусловно, обеспечит множество преимуществ по сравнению с существующими подходами, такими как трансгенные животные или нокаутирующие мыши. Это обеспечивает быструю производительность, низкую стоимость и потребность в умеренных технических навыках.

Мы надеемся, что этот методологический подход может быть разумным для существующих методов в области исследований мужской фертильности. Это может быть существенно полезно для решения широкого спектра вопросов, касающихся экспериментальных гени и процессов фертильности. Это было бы особенно возможно при использовании этого метода для генетического анализа в виде выигрыша всех экспериментов с потерей функции.

Можно предположить, что он будет очень полезен и для исследования регуляторных элементов, например, генов, специфичных для сперматогенеза. Чтобы начать процедуру, обезболите самца мыши в возрасте от шести до восьми недель смесью 10% кетамина и 2% ксилазина подкожно. Затем убедитесь, что мышь находится под глубоким наркозом путем защипывания пальцев ног.

Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость. Затем удалите волосы на животе с помощью электробритвы и после этого продезинфицируйте операционную область. Сделайте вентральный разрез непосредственно над железами PrepU в центре брюшной полости.

Для этого натяните кожу и проведите небольшой поперечный надрез кожи. Затем продолжайте по брюшному мышечному слою. Осторожно подтяните брюшные жировые пакеты, чтобы обнажить прикрепленное яичко, и поместите его на стерильную бумагу на животе.

Впоследствии с помощью стереомикроскопа найдите ЛОР-проток для микроинъекции. Это соединение тонких сосудов между яичком и придатком яичка, расположенное рядом с тестикулярной артерией. Удалите жировую ткань, которая покрывает ЛОР-проток, тонкими щипцами.

После этого поместите высвобождающий проток на стерильную бумажную полоску, убедившись, что проток хорошо виден, не причиняя вреда окружающей среде. Далее подсоедините пипетку для микроинъекций, которая ранее была загружена цветным раствором плазмиды, к инжектору микроманипулятора. После этого поместите иглу для микроинъекций параллельно протоку EENT кончиком в сторону яичка REIT.

Затем с помощью тонкого пинцета зачистите проток над пипеткой для микроинъекций. Убедитесь, что пипетка находится параллельно протоку во время ее перетягивания. Осторожно направьте иглу к яичку и остановитесь так же, как она проникнет в яичко REIT прямо под белочной оболочкой.

Далее задаем параметры микроинжектора. Затем начните вводить раствор генной конструкции. Контролируйте весь процесс инъекции, наблюдая за состоянием наполнения яичек.

С помощью цветного плазмидного раствора наращивают яичко только до двух третей его объема. Для обеспечения эффективной электропорации. Замочите электроды пинцета в одном PBS для обеспечения достаточной проводимости.

Затем слегка сожмите испытательный слой между мокрыми электродами и измерьте электрическое сопротивление с помощью электропараты. Затем установите электро в достаточной степени, гарантируя, что ток может быть подан на яичко с общим количеством восьми квадратных импульсов. В четырех разных местах проведения электропорации проводится комплексно вокруг всего яичка.

После завершения электропорации поместите яичко обратно в брюшную полость как можно ближе к его первоначальному местоположению. Так внутренний мышечный слой представлял собой рассасывающийся хирургический шов. Затем закройте кожу шовными зажимами.

Дайте мыши восстановиться после анестезии. В стерильный ящик утеплен на 37 градусов Цельсия грелка, подготовленная с помощью нескольких бумажных полотенец. Прокладка должна обеспечивать прогрев только одной половины клетки, создавая градиент тепла.

Кроме того, накройте мышь еще одним листом бумажного полотенца, чтобы еще больше снизить стресс. После того как животное полностью проснется, пересадите его в новую чистую, полностью оборудованную клетку. Но дальше восстановление, следите за процессом восстановления до тех пор, пока вы окончательно не вернете мышь в помещение для животных.

На этом рисунке показаны все яички Маунта через три дня после электропорации in vivo с помощью флуоресцентного детектирования, трансфицированные яички мыши C 57 black six показывают усиленный зеленый флуоресцентный белок или красный флуоресцентный белок. Здесь представлены гистологические срезы яичка. Через три дня после односторонней электропорации с помощью ПЭЭ, ФПК ПЭГ, трансфицированные семенные трубчатые клетки иллюстрируются зеленой флуоресценцией вместе с их типичной сферически организованной структурой.

Их ядра были уравновешены двумя про три в синем цвете. Во время выполнения этой процедуры важно помнить о том, что процессы идентификации ЛОР-протока и высвобождения им жировой ткани довольно сложны. Таким образом, вы можете сначала попрактиковаться на мертвом животном, прежде чем получить реальный опыт in vivo.

После предотвращения микроинъекционной электропорации и окончательного тестового сбора можно выполнить множество методов, таких как Q-R-T-P-C-R ship и вестерн-блоттинг. Следовательно, ксининг гена тестера является паттерном экспрессии белка, а также посттрансляционные модификации являются само собой разумеющимися. Таким образом, с помощью этих инструментов можно атаковать огромное количество тем, таких как, например, сперматогенез с его лежащими в его основе сложными механизмами и регуляциями.