Выделение Мышиный лимфатических узлов стромальных клеток

Выделение стромальных клеток лимфатических узлов - это многоступенчатая процедура, включающая ферментативное разложение и механическую дезагрегацию для получения фибробластических ретикулярных клеток, лимфатических клеток и эндотелиальных клеток крови. В описанной процедуре короткое сбраживание сочетается с автоматизированной механической дезагрегацией для минимизации деградации поверхностных маркеров жизнеспособных стромальных клеток лимфатических узлов.

Общей целью этой процедуры является выделение стромальных клеток лимфатических узлов. Это достигается путем предварительного разрушения капсулы лимфатического узла. На втором этапе фрагменты лимфатических узлов расщепляются коллагеназой четыре и Dnase одна.

Затем ферменты заменяются коллагеназой D и D-назой, а фрагменты механически дезагрегируются с помощью автоматизированной многоканальной пипетки. В конечном счете, экспрессия молекул на клеточной поверхности изолированных клеток лимфатических узлов может быть охарактеризована с помощью проточной цитометрии. Основное преимущество этого метода перед существующим методом заключается в том, что при этом методе клетки SHR лимфатических узлов расщепляются с использованием стандартизированной ферментативной процедуры, дополненной механической дезагрегацией, которая сохраняет жизнеспособность и экспрессию поверхностных молекул клеток.

Начните с помещения рассеченных лимфатических узлов в стерильную чашку Петри, содержащую два миллилитра ледяной среды. Затем с помощью двух одномиллилитровых шприцев, оснащенных иглами 25 калибра, можно нарушить работу капсул лимфатических узлов. Далее перенесите разрушенную ткань в пятимиллилитровую коническую пробирку, содержащую 750 микролитров среды, дополненную коллагеназой четыре и ДНК один, а также магнитную мешалку.

Затем поместите трубку в стакан с водой, нагретой до 37 градусов Цельсия, на магнитную мешалку и помешивайте клеточные суспензии со скоростью один круг в секунду в течение 30 минут. После перемешивания дайте осесть фрагменту лимфатического узла и затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Теперь обогащенные для нестромальных клеток переносят в лимфатический узел фрагменты 750 микролитров свежей среды, дополненной коллагеназой D и D назой, а затем перемешивают ткани еще пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем с помощью автоматизированной многоканальной пипетки дезагрегируйте фрагменты ткани лимфатических узлов в объеме 700 микролитров в течение 10 циклов с максимальной скоростью, а затем снова перемешайте фрагменты ткани через 10 минут. Далее дезагрегируйте комки ткани с помощью автоматизированной многоканальной пипетки в течение 99 циклов с максимальной скоростью. Затем добавьте в пробирку 7,5 микролитров 0,5 моляра ЭДТА и перемешайте тканевую суспензию еще 99 циклов с помощью автоматической пипетки.

После последнего цикла дезагрегации добавьте в клеточный раствор 750 микролитров среды и отфильтруйте клетки через нейлоновую сетку толщиной 70 микрометров. Затем гранулируйте клетки в течение пяти минут при температуре 1500 G и четырех градусах Цельсия. Для визуализации популяций стромальных клеток лимфатических узлов с помощью проточной цитометрии окрашивайте соответствующие образцы клеток с помощью трекера живых мертвецов и представляющих интерес антител в 100 микролитрах HBSS, содержащих 2% FCS, в течение не менее 20 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.

Затем промойте клетки в 500 микролитрах HBSS с FCS и восстановите. Гранулы в 100 микролитрах HBSS и FCS запускают клетки на проточном цитометре, удаляя CD 45 положительные клетки для исключения гемопоэтических клеток, а затем проводят марш на живой популяции синглетов. Наконец, сравните GP 38 с CD 31 для визуализации ретикулярных клеток Т-зоны, лимфатических эндотелиальных клеток, эндотелиальных клеток крови и двойных отрицательных клеток.

Клеточные популяции. Общее количество клеток, восстановленных после переваривания субпопуляций стромальных клеток лимфатических узлов, было немного выше в только что продемонстрированном протоколе по сравнению с протоколами Линка и Флетчера, демонстрирующими, что жизнеспособность стромальных клеток лимфатических узлов после выделения по этому протоколу аналогична жизнеспособности при использовании опубликованных протоколов. Ретикулярные клетки Т-зоны и лимфатические эндотелиальные клетки, выделенные с помощью этого протокола, а также линка и Флетчера, сравнивали экспрессию IAB CD one 40 a CD 80, PD L one и CD 40.

Экспрессия всех пяти поверхностных молекул была выше при расщеплении с только что продемонстрированным протоколом и протоколом связи для обоих подмножеств стромальных клеток, что позволяет предположить, что деградация некоторых поверхностных молекул коллагеназой 4 и D менее устойчива, чем при использовании коллагеназы p и пространства DYS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как успешно изолировать четыре основные субпопуляции клеток стромы лимфатических узлов, сохраняя при этом экспрессию нескольких поверхностных молекул, что полезно для их дальнейшей характеристики и анализа.