Выделение Мышиный лимфатических узлов стромальных клеток
19 августа 2014 г.
Выделение стромальных клеток лимфатических узлов - это многоступенчатая процедура, включающая ферментативное разложение и механическую дезагрегацию для получения фибробластических ретикулярных клеток, лимфатических клеток и эндотелиальных клеток крови. В описанной процедуре короткое сбраживание сочетается с автоматизированной механической дезагрегацией для минимизации деградации поверхностных маркеров жизнеспособных стромальных клеток лимфатических узлов.
Общей целью этой процедуры является выделение стромальных клеток лимфатических узлов. Это достигается путем предварительного разрушения капсулы лимфатического узла. На втором этапе фрагменты лимфатических узлов расщепляются коллагеназой четыре и Dnase одна.
Затем ферменты заменяются коллагеназой D и D-назой, а фрагменты механически дезагрегируются с помощью автоматизированной многоканальной пипетки. В конечном счете, экспрессия молекул на клеточной поверхности изолированных клеток лимфатических узлов может быть охарактеризована с помощью проточной цитометрии. Основное преимущество этого метода перед существующим методом заключается в том, что при этом методе клетки SHR лимфатических узлов расщепляются с использованием стандартизированной ферментативной процедуры, дополненной механической дезагрегацией, которая сохраняет жизнеспособность и экспрессию поверхностных молекул клеток.
Начните с помещения рассеченных лимфатических узлов в стерильную чашку Петри, содержащую два миллилитра ледяной среды. Затем с помощью двух одномиллилитровых шприцев, оснащенных иглами 25 калибра, можно нарушить работу капсул лимфатических узлов. Далее перенесите разрушенную ткань в пятимиллилитровую коническую пробирку, содержащую 750 микролитров среды, дополненную коллагеназой четыре и ДНК один, а также магнитную мешалку.
Затем поместите трубку в стакан с водой, нагретой до 37 градусов Цельсия, на магнитную мешалку и помешивайте клеточные суспензии со скоростью один круг в секунду в течение 30 минут. После перемешивания дайте осесть фрагменту лимфатического узла и затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Теперь обогащенные для нестромальных клеток переносят в лимфатический узел фрагменты 750 микролитров свежей среды, дополненной коллагеназой D и D назой, а затем перемешивают ткани еще пять минут при температуре 37 градусов Цельсия.
Затем с помощью автоматизированной многоканальной пипетки дезагрегируйте фрагменты ткани лимфатических узлов в объеме 700 микролитров в течение 10 циклов с максимальной скоростью, а затем снова перемешайте фрагменты ткани через 10 минут. Далее дезагрегируйте комки ткани с помощью автоматизированной многоканальной пипетки в течение 99 циклов с максимальной скоростью. Затем добавьте в пробирку 7,5 микролитров 0,5 моляра ЭДТА и перемешайте тканевую суспензию еще 99 циклов с помощью автоматической пипетки.
После последнего цикла дезагрегации добавьте в клеточный раствор 750 микролитров среды и отфильтруйте клетки через нейлоновую сетку толщиной 70 микрометров. Затем гранулируйте клетки в течение пяти минут при температуре 1500 G и четырех градусах Цельсия. Для визуализации популяций стромальных клеток лимфатических узлов с помощью проточной цитометрии окрашивайте соответствующие образцы клеток с помощью трекера живых мертвецов и представляющих интерес антител в 100 микролитрах HBSS, содержащих 2% FCS, в течение не менее 20 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.
Затем промойте клетки в 500 микролитрах HBSS с FCS и восстановите. Гранулы в 100 микролитрах HBSS и FCS запускают клетки на проточном цитометре, удаляя CD 45 положительные клетки для исключения гемопоэтических клеток, а затем проводят марш на живой популяции синглетов. Наконец, сравните GP 38 с CD 31 для визуализации ретикулярных клеток Т-зоны, лимфатических эндотелиальных клеток, эндотелиальных клеток крови и двойных отрицательных клеток.
Клеточные популяции. Общее количество клеток, восстановленных после переваривания субпопуляций стромальных клеток лимфатических узлов, было немного выше в только что продемонстрированном протоколе по сравнению с протоколами Линка и Флетчера, демонстрирующими, что жизнеспособность стромальных клеток лимфатических узлов после выделения по этому протоколу аналогична жизнеспособности при использовании опубликованных протоколов. Ретикулярные клетки Т-зоны и лимфатические эндотелиальные клетки, выделенные с помощью этого протокола, а также линка и Флетчера, сравнивали экспрессию IAB CD one 40 a CD 80, PD L one и CD 40.
Экспрессия всех пяти поверхностных молекул была выше при расщеплении с только что продемонстрированным протоколом и протоколом связи для обоих подмножеств стромальных клеток, что позволяет предположить, что деградация некоторых поверхностных молекул коллагеназой 4 и D менее устойчива, чем при использовании коллагеназы p и пространства DYS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как успешно изолировать четыре основные субпопуляции клеток стромы лимфатических узлов, сохраняя при этом экспрессию нескольких поверхностных молекул, что полезно для их дальнейшей характеристики и анализа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод выделения стромальных клеток лимфатических узлов с помощью сочетания ферментативного переваривания и механической диссоциации. Целью данного метода является сохранение жизнеспособности и экспрессии поверхностных маркеров выделенных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Иммунология
- Исследования стромальных клеток
Теоретические сведения
- Стромальные клетки лимфоузлов играют критическую роль в иммунных ответах.
- Методы изоляции имеют важное значение для изучения этих клеток.
- Существующие методы могут негативно влиять на жизнеспособность клеток и сохранность поверхностных маркеров.
- В данной работе представлен усовершенствованный метод, позволяющий решить эти проблемы.
Цель исследования
- Эффективно выделить жизнеспособные стромальные клетки лимфоузлов.
- Сохранить экспрессию поверхностных молекул в процессе выделения.
- Усовершенствовать существующие методы выделения.
Используемые методы
- Разрушение капсулы лимфатического узла.
- Переваривание с помощью коллагеназы и ДНКазы.
- Механическая диссоциация с использованием автоматизированной многоканальной пипетки.
- Характеристика молекул поверхности клеток с помощью проточной цитометрии.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно изолировать стромальные клетки лимфатических узлов.
- Жизнеспособность клеток и экспрессия поверхностных маркеров сохраняются.
- Проточная цитометрия подтверждает целостность изолированных клеток.
- Данная методика демонстрирует преимущества по сравнению с традиционными методами.
Выводы
- Данный усовершенствованный метод изоляции расширяет возможности изучения стромальных клеток лимфатических узлов.
- Он предлагает стандартизированный подход к изоляции клеток.
- Результаты данной работы могут быть использованы в будущих иммунологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция жизнеспособных стромальных клеток лимфатических узлов с сохранением экспрессии поверхностных маркеров позволяет снизить механистические риски при валидации иммуномодулирующих мишеней. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет сохранения точности перекрестного взаимодействия между стромальными и иммунными клетками. Он позволяет решить критическую задачу на этапе поиска новых лекарственных средств, когда целостность стромальных клеток влияет на согласованность трансляционных биомаркеров и решения по приоритизации портфеля препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать стромально-иммунные взаимодействия в регуляции цитотоксического Т-клеточного ответа.
- Практическая ценность: сохраняет экспрессию поверхностных молекул CD31 и gp38 для точной идентификации субпопуляций.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков при изучении стромальных мишеней в путях гомеостаза лимфоидной ткани.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные суспензии одиночных клеток для проведения воспроизводимых анализов методом проточной цитометрии.
- Практическая ценность: сочетает ферментативное переваривание с автоматизированной механической диссоциацией для повышения выхода и жизнеспособности клеток.
- Научная ценность: предоставляет количественные показатели восстановления стромальных клеток для стандартизации анализа и обеспечения воспроизводимости результатов между различными лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет функциональность стромальных клеток для последующего анализа активации и дифференцировки лимфоцитов.
- Практическая ценность: Обеспечивает стабильное выделение ретикулярных клеток Т-зоны, эндотелиальных клеток лимфатических сосудов, эндотелиальных клеток крови и двойных отрицательных субпопуляций.
- Научная ценность: Способствует согласованию трансляционных биомаркеров за счет сохранения поверхностных молекул, участвующих во взаимодействии стромальных и иммунных клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, где жизнеспособность стромальных клеток и сохранение маркеров имеют решающее значение для проверки гипотез и уточнения путей в исследованиях иммуномодуляции.
- Открытия в биологии: Обеспечивает изоляцию стромальных клеток для функциональной валидации мишеней в микроокружении лимфоидной ткани.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые суспензии единичных клеток для проведения стандартизированных анализов на основе стромальных клеток.
- Аналитика: Создает образцы, готовые к проточной цитометрии, для количественного анализа поверхностных маркеров и дифференциации подмножеств клеток.
- Трансляционные исследования: Сохраняет целостность интерфейса «строма-иммунная система» для обеспечения преклинической преемственности в моделях лимфоидной ткани.
- Корпоративное использование: Устанавливает стандартизированный ферментативно-механический протокол, адаптируемый для различных рабочих процессов по изоляции стромальных клеток лимфоидной ткани.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации стромальных мишеней за счет сохранения экспрессии поверхностных молекул.
- Операционная ценность: Стандартизированный протокол снижает вариабельность при выделении стромальных клеток в различных экспериментах.
- Стратегическая ценность: Обоснование решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет уменьшения механистической неопределенности в исследованиях взаимодействия стромальных и иммунных клеток.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию стромальных мишеней с учетом рисков на основе надежных доклинических данных по стромальным клеткам.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с протоколами ферментативного расщепления тканей и окрашивания для проточной цитометрии.
- Зависит от наличия автоматизированного многоканального дозатора для механической диссоциации, а также наличия коллагеназы и ДНКазы.
- Необходима стандартизация времени расщепления и количества циклов механического воздействия для всех пользователей и лабораторий.
- Требуется адаптация концентраций ферментов для различных источников лимфоидной ткани или подмножеств стромальных клеток.
- Ограничено чувствительностью стромальных клеток к длительному воздействию ферментов, что требует строгого соблюдения временных интервалов на этапах разрушения ткани.
