Визуализация клатрином эндоцитоза из G-белками в Single-событий резолюции через TIRF микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке динамики отдельных ямок, покрытых клатрином, в живых клетках. Это достигается путем первого пересечения флуоресцентно меченых эндоцитарных и карго-белков в клеточную линию адгезии. Следующим шагом является визуализация клеток с помощью полного внутреннего отражения, флуоресценции или микроскопии.

Срок службы небольших наборов ямок с клатриновым покрытием затем количественно оценивается вручную с помощью программы обработки и анализа изображений. Последним шагом является количественная оценка срока службы ямок, покрытых клатрином, с помощью объективного автоматического обнаружения и анализа. В конечном счете, газонная микроскопия используется для количественной оценки динамики отдельных ямок, покрытых клатрином, с разрешением одного события для исследования опосредованного клатрином эндоцитоза рецепторов, сопряженных с G-белком.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранного транспорта, например, как сборка и динамика эндоцитоза могут изменяться в зависимости от различных присутствующих эндоцитарных белков и грузовых белков. Начать трансфекцию HEC 2 93 клеток плазмидами, кодирующими рецепторы, сопряженные с G-белком, или GPCR и/или компоненты механизма Claro. В 12-луночный планшет, как указано в текстовом протоколе, на следующий день после трансфекции добавьте 0,5 миллилитра фосфатно-солевого буфера или PBS с одним миллимолярным ЭДТА в каждую.

Ну а затем помещаем три патрона стерильной 25 миллиметровой крышкой в отдельные лунки по шестерке. Пластина для лунок Заполните каждую лунку двумя миллилитрами среды. Осторожно опустите крышку на дно лунки, чтобы предотвратить рост клеток на нижней стороне защитного стекла.

Затем вручную перемешайте лунку 12-луночной пластины, чтобы оторвать ячейки со дна лунки. Добавьте один миллилитр DM EM с 10% FBS для повторной отправки. Затем приподнятые ячейки из одной лунки равномерно распределите между тремя покровными листами.

Дайте клеткам расти на покровных листах не менее 48 часов перед визуализацией. Также убедитесь, что ячейки рассредоточены и плоские для визуализации ямы, покрытой клатрином, и динамики груза. Во-первых, предварительно инкубируйте клетки с антителами, как описано в текстовом протоколе.

Затем подготовьтесь к переносу покровного стекла в камеру для визуализации живых клеток с помощью пары щипцов и иглы 25 калибра, согнутой на кончике в крючок. Держите пару щипцов в доминирующей руке. Зажмите согнутую иглу в другой.

Поворачивайте иглу до тех пор, пока крючок не изгибается вниз в сторону стакана. Осторожно проведите игольным крючком вниз по дну шестилуночной пластины, пока он не зацепится за крышку. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать поверхность защитного стекла, так как это приведет к отсоединению ячеек.

Аккуратно поднимите крышку слипа вверх со дна колодца. Уравновесьте защитный слип у стенки колодца для поддержки. С помощью щипцов ухватитесь за край покровного накладки и переместите сторону ячейки покровного слипа вверх к камере визуализации.

Соберите камеру и добавьте 700 микролитров предварительно прогретого носителя для визуализации. После переноса камеры на микроскоп сфокусируйте клетки с помощью объектива с помощью погружного изображения в обычных эпи-, флуоресцентных или конфокальных режимах освещения, чтобы идентифицировать клетки, экспрессирующие соответствующие конструкции, в качестве важной меры предосторожности. Всегда помните об угле лазерного луча и всегда направляйте его в сторону от наблюдателя.

Затем сосредоточьтесь вниз к нижней поверхности экспрессирующей клетки до тех пор, пока контур плазматической мембраны вокруг клетки не исчезнет и не появится нижняя поверхность клетки. Это наиболее очевидно в случае локализованного карго-белка плазматической мембраны, такого как мю-опиоидный рецептор. При использовании одних и тех же лазеров для визуализации в обычной эпифлуоресценции увеличивайте угол падения лазера до выхода из фокуса.

Флуоресценция внутри клетки исчезает, и не видно контуров плазматической мембраны вокруг клетки. Оказавшись на газоне, убедитесь, что возбуждающий лазер отражается обратно через объектив и не виден над объективом. Проверив, видно ли лазерное пятно, уточните фокус, чтобы получить четкое изображение.

После того, как клетки будут идентифицированы, получайте изображения не реже одного раза в три секунды в течение 10 минут. Повторите все шаги, чтобы отобразить дополнительные ячейки. Чтобы начать анализ эндоцитарной динамики, откройте файл на изображении J. Изображения хранятся в виде единой стопки файлов TIFF.

С межстворчатыми каналами. Преобразуйте изображения в гиперстопки, выбрав гиперстопки изображений и стопку в гиперстопку во всплывающем окне. Введите количество приобретенных каналов.

Введите единицу для Зака и введите количество кадров фильма. Формат гиперстека дает окно с двумя полосами прокрутки. Используйте верхнюю панель для перемещения по каналам, а нижнюю — для перемещения во времени.

Прокрутите до канала белка, время жизни которого будет проанализировано. Выйдите за пределы первого кадра фильма, чтобы уменьшить количество ранее существовавших ямок с покрытием клатрином или КПК, вся продолжительность которых не видна. Нарисуйте область интереса или ROI вокруг места, выбранного случайным образом.

Подсчитайте количество кадров, на которых видно пятно. Чтобы начать анализ с распознавания объектов, откройте файл необработанного изображения в программном обеспечении для анализа изображений по умолчанию. Появится цветное изображение.

Используйте окно настройки дисплея для регулировки яркости канала. Нажмите на название канала, чтобы изменить отображаемый цвет. Снимите флажок рядом с каналом, чтобы запретить его показ.

Создавайте пятна, нажимая на иконку с оранжевыми пятнами. Выберите ROI вокруг ячейки, используя его, чтобы исключить области, которые будут неправильно обнаруживать яркие передние края и бляшки. Измерьте диаметр пятна, чтобы получить первоначальные оценки для алгоритма.

Переключитесь в режим среза и щелкните по полярным концам пятна, чтобы измерить его диаметр. Проделайте это для четырех или пяти круглых пятен, которые указывают на ККТ на высоте его стабильности после формирования до цессии, используя эти измерения для расчета среднего диаметра с точностью до 10-й доли микрона. Чтобы обнаружить пятна, вернуться в режим превышения, выберите подходящий канал для обнаружения.

Введите средний измеренный диаметр, обычно 0,3 или 0,4 мкм. Нажмите на синюю стрелку вперед, чтобы количественно определить количество пятен. Отфильтруйте пятна по качеству, настроив фильтр, чтобы захватить как можно больше мест без фона.

Фильтр качества выбран по умолчанию. Используйте кривую качества в качестве ориентира для установки соответствующего порогового значения. Переместите нижний порог фильтра левой кнопкой мыши к этому первому углублению кривой.

Это хорошая отправная точка для фильтра. Так как это положение обычно уточняет обнаружение только до видимых пятен. Удалите арантовые пятна в окне редактирования экрана, переключитесь на выбор режима и нажмите на пятно После того, как оно станет желтым, нажмите удалить.

Затем нажмите на синюю стрелку, чтобы продолжить построение алгоритма. Измеряйте следы, устанавливая следы в положение «Брауни» в движении. КПК не должна демонстрировать никакого направленного движения, только минимальное дрейф по плазматической мембране.

Этот алгоритм наиболее подходит для данного движения. Затем установите максимальное расстояние на небольшое значение, например 0,7 мкм. Установка небольшого расстояния сводит к минимуму соединение соседних точек и при этом позволяет продолжать отслеживание точки клетки через КТК или движение клетки.

Затем установите максимальный размер зазора равным единице. Это позволяет продолжить трек, если отсутствует только один кадр. При последовательности зазоры размером более трех приводят к тому, что разные дорожки неправильно соединяются друг с другом.

Следующим шагом будет переключение просмотра трека на хвост дракона. Прокрутите видеоролик, наблюдая за качеством обнаружения. Если соединяются соседние точки, уменьшите максимальное расстояние до 0,7 мкм.

Если пятна разбиваются слишком быстро, увеличьте максимальный размер зазора. Нажмите на синюю стрелку, чтобы создать треки. Это приведет к экрану фильтрации треков для фильтрации треков.

Используйте фильтр интенсивности, чтобы удалить дополнительные яркие бляшки. Затем используйте фильтр смещения для удаления эндосом, которые попадают на поле газона. Будьте осторожны, так как более длинные пятна также будут иметь большее смещение.

Нажмите на зеленую двойную стрелку, чтобы завершить протокол. Чтобы экспортировать данные, перейдите во вкладку статистики. Нажмите на иконку одной дискеты, чтобы экспортировать выбранную статистику.

Нажмите на иконку, которая выглядит как серия дискет, чтобы экспортировать всю статистику. Фокусировка на адгезивной плазматической мембране А и конфокальной моде позволяет увидеть клетку, которая заполнена тусклой флуоресценцией. Напротив, фокусировка на центре клетки показывает плазматическую мембрану в виде флуоресцентного кольца вокруг клетки.

Флуоресценция вне фокуса становится очевидной при переключении на обычную эпи, флуоресценцию или газон с неправильным углом. Когда угол наклона газона правильный, плазматическая мембрана становится очень четкой, четкой и яркой, а также не фокусируется. Флуоресценция больше не нарушает изображение.

Когда бета-аррестин находится в цитозольном бассейне, его очень мало в газоне, и оно выглядит туманным и внешним очагом. Как только MOR активируется агонистом, бета, аррестин возвращается к плазматической мембране, и как бета-аррестин, так и рецептор перераспределяются в ЦПК. Время жизни этих кластеров количественно оценивается вручную.

Используя три параметра для завершенного эндоцитоза, пятна, обозначающие ЦКК, могут полностью исчезать, включаться и выключаться или отщипывать более крупную структуру. На рисунке показаны ККТ, обнаруженные с помощью MAs После фильтрации для удаления нединамических структур бляшек, наложенных белых сфер, обозначения обнаруженных пятен, более тусклых пятен, которые не могли быть обнаружены в течение всего срока их жизни, также были исключены с помощью фильтра качества. После просмотра этого видео у вас должно быть действительно хорошее понимание того, как визуализировать отдельные катетерные ямки с помощью микроскопии.