Быстрое Анализ хромосомных аберраций в Mouse-лимфоцитов на PNA-FISH

Общей целью данного эксперимента является количественная оценка геномной нестабильности в В-лимфоцитах мыши. Это достигается путем первичной изоляции В-клеток для первичной клеточной культуры. Далее ячейки фиксируются, что облегчает подготовку метафазных спредов.

Наконец, для визуализации флуоресцентно меченных теломер проводится ПНК теломер рыб. В конечном счете, уровень различных типов хромосомных аберраций может быть количественно определен с помощью флуоресцентной микроскопии. Применение этого метода может расширить наше понимание путей репарации ДНК, поскольку он может помочь идентифицировать гены, которые способствуют стабильности генома в наших целевых моделях мышей.

Хотя этот метод может дать представление о разрывах хромосом и других крупных хромосомных перестройках, он также может быть адаптирован для измерения других форм геномной нестабильности, таких как транслокации. Чтобы изолировать В-клетки, начните с помещения только что выделенной селезенки в 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую два миллилитра буфера для мытья белья, в ламинарном проточном колпаке. Затем с помощью задней части поршня от пятимиллилитрового шприца аккуратно мацерировать селезенку.

Затем отфильтруйте тканевую кашицу через нейлоновое сетчатое ситечко 70 микрометров в трубку объемом 50 миллилитров с помощью поршеня и аккуратно надавите на более крупные кусочки ткани через ситечко. Промойте пластину и шприц восемью миллилитрами буфера для стирки, и отфильтруйте средство для промывки через ситечко. Затем, после вращения клеток, несколько раз пипетируйте гранулу вверх и вниз в трех миллилитрах буфера для лизиса CK.

Через пять минут остановите реакцию с помощью 10 миллилитров промывочного буфера. Затем, снова раскрутив ячейки, постучите по дну пробирки, чтобы повторно суспендировать гранулу, и добавьте в ячейки один миллилитр буфера для промывки. Затем инкубируйте клетки с 50 микролитрами микрогранул anti CD 43 max на льду.

Через 30 минут аккуратно промойте клетки в 10 миллилитрах буфера для стирки. Во время центрифугирования поместите минимаксную колонку на магнит и промаркированную коническую трубку объемом 15 миллилитров под колонкой. Затем добавьте в колонку один миллилитр промывочного буфера, собирая ЭИТ в пробирку.

Восстановите суспендию клеточной гранулы в одном миллилитре промывочного буфера, а затем загрузите ячейки в колонку После того, как образец пройдет, промойте колонку одним миллилитром промывочного буфера и добавьте семь миллилитров промывочного буфера непосредственно в собранный образец. После подсчета собранных клеток переложите их в 50-миллилитровую пробирку для центрифугирования. Затем, чтобы активировать В-клетки, повторно суспендируйте гранулу в 10 из шести клеток на миллилитр в добавке В-клеточной среды и инкубируйте клетки в шести луночных планшетах по пять миллилитров клеток на лунку во влажном инкубаторе для клеточных культур при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе для фиксации В-клеток.

Далее по 50 микролитров мида в каждую из лунок. После часовой инкубации при температуре 37 градусов Цельсия перенесите В-клетки в пробирку объемом 15 миллилитров. Накройте этикетку скотчем и закрутите ячейки вниз.

Затем аспирируйте все, кроме одного миллилитра надосадочной жидкости, и повторно суспендируйте гранулу с помощью пипетирования. Добавляем пять миллилитров 37 градусов по Цельсию, хлорид калия, капля за каплей, пульсируя на вихре. Затем добавьте дополнительно 10 миллилитров хлористого калия и перемешайте клеточный раствор методом инверсии.

Далее инкубируйте клетки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем добавьте пять капель свежего фиксирующего перемешивания еще раз путем инвертирования. Затем раскрутите клетки после суспензии гранулы в одном миллилитре надосадочной жидкости, добавьте пять миллилитров свежего фиксатора, капля за каплей, пульсируя на вихре и инкубируйте клетки и дополнительно 10 миллилитров фиксатора при комнатной температуре.

Через 30 минут гранулируйте клетки и удалите все фиксаторы, кроме одного миллилитра. Затем после промывания клеток, еще два раза по 15 миллилитров фиксатора, повторно суспендируйте гранулу в итоговых 70 микролитрах надосадочной жидкости. Теперь поместите промаркированные предметные стекла под углом 35 градусов в камеру влажности, установленную на 22,9 градуса Цельсия и влажность 52%.

Капните по 35 микролитров ресуспендированных В-клеток на каждое предметное стекло, приготовив по два предметных стекла для каждого образца. Затем, дав предметным стеклам высохнуть в камере влажности в течение 30 минут, храните слайды в слайд-боксе при температуре 37 градусов Цельсия до полного высыхания. После высыхания с помощью алмазной ручки отметьте область 18 на 18 миллиметров для гибридизации на обратной стороне каждого предметного стекла, чтобы денатурировать предметные стекла для рыб.

Далее нанесите 120 микролитров 70% деионизированной формы амида на покровные стекла размером 24 на 60 миллиметров, а затем прикоснитесь каждым предметным стеклом к покровному листу. Денатурируйте слайды на конфорке с температурой 80 градусов Цельсия в течение 90 секунд, а затем быстро и осторожно соскользните с защитных стекол и последовательно. Поместите предметные стекла в ледяной 70, 90 и 100% этанол каждый на три минуты После того, как стекла высохнут, поместите предметные стекла во влажную камеру и нанесите предварительно необходимый зонд Смешайте на отмеченные участки на предметных стеклах.

Накройте смесь зондов защитным стеклом размером 18 на 18 мм и инкубируйте предметные стекла при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем вымойте горки в заранее предупрежденных двух XSSC с встряхиванием. Через пять минут нанесите на предметные стекла 35 микролитров монтажной среды для мойала.

Накройте среду защитными стеклами размером 24 на 60 миллиметров и храните предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия. Наконец, проанализируйте метафазные стекла с помощью стандартного эпифлуоресцентного микроскопа. Метафазные хромосомы, полученные из одной клетки мыши, должны образовывать дискретный кластер, содержащий 40 хромосом.

Каждая хромосома имеет центромеру на одном конце, близкую к двум сигналам теломер, а также два дополнительных сигнала теломер на другом конце хромосомы. Хроматидные разрывы — это разрывы в одной из двух сестринских хроматид, составляющих каждую метафазную хромосому. В некоторых случаях сломанный конец хромосомы может наблюдаться в виде фрагмента с сигналами теломер в том же метафазном распределении.

Радиохромосомы представляют собой сложные перестройки, включающие две хромосомы. Хромосомы также могут соединяться, образуя дицентрические хромосомы, которые проявляются как слияние хромосом с центромерами на обоих концах. Робертсоновские транслокации — это тип транслокации между центромерами двух хромосом, которые выглядят как четыре сестринских хроматных плеча, прикрепленных к одной центромере.

На этом последнем изображении показана метафаза, в которой отсутствуют сигналы теломер. Отсутствие сигналов теломер может возникать из-за ошибок при подготовке зонда или из-за пузырьков воздуха под покровным стеклом при гибридизации. После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как анализ клеточного цикла и информация о толстой кишке, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, влияет ли повышенная нестабильность генома на жизнеспособность клеток.