Мультимодальные оптической микроскопии Методы Reveal полип Tissue морфологии и структуры в карибских рифовых рифостроители

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы получить изображение коралловых полипов толщиной от одного до двух миллиметров в 3D, чтобы понять тонкую структуру, а также коралловые пигменты и их локализацию. Это достигается путем сначала погружения образца в воск, а затем разрезания образца на участки размером в один микрон с помощью микротома. Затем используется специально разработанная техника серийного блока для визуализации коралловых полипов и реконструкции 3D-изображения.

Используя несколько 2D-изображений, были получены результаты, которые показывают способность метода разрешать мелкие структурные детали коралловой ткани без нарушения ее структурной целостности. Демонстрируем процедуру. Сегодня будет доктор Маунде Шива гуру, сотрудник моей исследовательской группы.

Для приготовления предварительного фильтрационного воска растопите 3,6 грамма бычка в хлопьях в стеклянном стакане на горячей плите. Далее добавьте 400 миллиграммов судана. В-четвертых, чтобы свести к минимуму флуоресценцию воскового фона, хорошо перемешать и подождать, пока не получится красный полупрозрачный раствор.

Затем добавьте 81 грамм парафина и хорошо перемешайте. Впоследствии добавьте 15 грамм белого гранулированного бруска VI и полностью расплавьте в том же стакане. После того, как он растает, перемешайте его еще раз, чтобы получить полностью смешанный восковой раствор.

Теперь добавьте смесь в стеклянную бутылку и неплотно закройте крышкой. Поместите стеклянную бутылку в конвекционную печь с температурой 60 градусов Цельсия, чтобы ингредиенты оставались в жидком состоянии и чтобы произошла вся инфильтрация. Такой раствор можно сделать до 200 миллилитров и разделить на две бутылки по 100 миллилитров.

Один образец для инфильтрации и один для окончательной заделки кораллов в Карибском бассейне были собраны в Австралийском союзе и закреплены в параформальдегиде в полевых условиях. Чтобы внедрить коралловые ткани для SBFI, сначала промойте коралловые полипы, собранные в полевых условиях, и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в параформальдегиде. После этого промойте их в PB S3 раз в течение пяти минут каждый раз, когда будете готовы к съемке.

Декальцинируйте полипы в растворе ex Cal two в течение 24 часов или до тех пор, пока полипы полностью не лишатся карбоната кальция. Инкубируйте несколько декальцинированных коралловых полипов в виде одного блока в рядах из 25, 50, 75 и 100% этанола, а затем один x ксилол. Заменяйте на 30 минут каждый сеанс, чтобы обезвоживать образцы.

Далее поместите обработанные полипы в 100% ксилол. Замените в духовке при температуре 65 градусов Цельсия на 30 минут. После этого замените свежим раствором и выдержите еще 30 минут.

Расположите полипы верхушками вниз, а поверхность как можно более ровной. Составляйте решения два к одному, один к одному и один к двум. Заменитель ксилола и воск для предварительной фильтрации.

В 50-миллилитровых пробирках Falcon инкубируются коралловые полипы с этими тремя возрастающими концентрациями предварительного фильтрационного воска, после чего следует три инкубации в 100% предварительном фильтрационном воске в течение от 30 минут до одного часа каждый раз. Теперь перенесите образец на закладочный воск. Удалите засыпной воск через 30 минут, затем замените его свежим закладным воском и продолжайте инкубацию в течение как минимум четырех часов при температуре 65 градусов Цельсия.

После этого сфотографируйте блок. Это необходимо, потому что после погружения в воск местоположение образца станет невидимым, так как красный воск для встраивания непрозрачен. Затем поместите небольшие капли воска с высокой температурой плавления вокруг новой предварительно нагретой формы для встраивания нержавеющей стали и дайте ей остыть.

Налейте небольшой объем свежерасплавленного и подстилающего воска из второй аликвоты и быстро расположите коралловый полип лицевой стороной вниз над белой восковой точкой. Затем поместите пластиковый держатель для образцов на лоток из нержавеющей стали и налейте еще засыпного воска, чтобы воск подошел к поверхности пластиковой формы. Теперь выньте всю установку из духовки при температуре 65 градусов Цельсия и дайте ей остыть на скамейке или прохладной поверхности, пока воск полностью не застынет.

После этого поместите высушенный блок в холодильник при температуре четыре градуса Цельсия, защищенный от света для длительного хранения для секционирования блока. Сначала обрежьте его и отрежьте срезы на один микрон. С помощью микротома можно получить изображение гладкого блока грани, на котором находится образец.

Каждый раз. Когда срез удаляется, образец появляется, когда белый воск начинает исчезать. Затем сделайте снимки с помощью монохромной камеры с использованием флуоресцентного фильтра, чтобы зафиксировать автофлуоресценцию хроматофоров или коралловых полипов, три-четыре декальцинированных ядра из каждого образца.

Чтобы выполнить двухфотонную флуоресцентную визуализацию, поместите ядра промытых коралловых полипов в 4% параформальдегида вверх ногами в закрытую стеклянную чашку на дне с помощью двухфотонного лазера с возбуждением изображения 780 нанометров от трех до четырех полипов при двух разных увеличениях с использованием объектива с 10-кратным увеличением. Затем используйте режим сканирования листов для сбора примерно от 25 до 100 изображений на фокальную плоскость в XY с интервалом 10 или 20 микрон. Затем соберите от 50 до 100 изображений по оси Z с интервалом 10 или 20 микрон, что составит в общей сложности от 5 000 до 10 000 изображений на коралловый полип.

После этого изображения три-четыре области полипа представляют ядро и виды кораллов. Затем сохраните все изображения в формате необработанных данных на жестком диске системы. В этой процедуре обрезайте 2D-данные, чтобы уменьшить размер файла, сосредоточившись на одном полипе с помощью инструмента квадратной обрезки, и скомпилируйте его как один файл TIF.

В комплектации программного обеспечения. Откройте собранные файлы данных SBFI или мозаичные множественные стеки Z двух фотонных оптических секций в программном модуле EMERIS surpass в проекте объемного алгоритма, данные SBFI визуализируются в 3D. Используя теневые проекции, создайте режим ISOSURFACE, в котором вокселы являются пороговыми для создания массива твердой поверхности.

Визуализируйте 3D-проекции с помощью алгоритма отсечения в ортогональных модах XY, xz и YZ, чтобы выявить 3D-структуру и форму кораллов. Затем анимируйте проекции с помощью модуля анимации по ключевым кадрам. В той же программе erris сгенерируйте видеофайлы со сжатием 5% и сгенерируйте видеоклипы в формате VI с использованием объемных 3D и изоповерхностных модальностей.

Вот два фотонных флуоресцентных 3D-изображения коралловых полипов из M Anis и Mfa Lata. Эти два изображения были получены без спектрального разделения компонент с использованием 780-нанометрового возбуждения двухфотонного лазера с оптическим сигналом, собранным от 450 до 700 нанометров, и эти два изображения были получены с одинаковым возбуждением, но для сбора данных от двух компонентов использовались одновременно два детектора фотоумножителя. один от 500 до 550 нанометров, а другой от 650 до 720 нанометров. Это изображения с глубинным покрытием.

Красный — самые мелкие, а синий — самые глубокие компоненты в 2D. да. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о правильной подготовке образца из красного воска. Комбинация последовательной блочной визуализации лица и флуоресцентной микроскопии с двух ног позволяет анализировать пигментацию кораллов и клеточную структуру на различных масштабах линз.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как обращаться с рифообразующими кораллами и их спектральными свойствами в трех измерениях и визуализировать их.