Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании пролиферации и дифференцировки клеток линии олигодендроцитов в среде, которая очень похожа на ту, которая обнаруживается in vivo. Это достигается путем предварительного получения культур срезов четырех мозгов и мозжечка от трансгенных мышей в раннем постнатальном периоде. Отдельные клетки в срезах затем визуализируются в течение нескольких часов или дней, чтобы визуализировать клеточную динамику их пролиферации и дифференцировки.

После визуализации используется апостериорная иммуногистохимия клеток для определения различных клеточных характеристик. В конечном счете, результаты могут показать динамику пролиферации и дифференцировки клеток в нормальных условиях и после фармакологических или генетических манипуляций. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как диссоциированный уголь, культуры нейронов и клетки линии лиги-инцитов заключается в том, что срезные культуры позволяют манипулировать бесклеточной средой, сохраняя при этом тканевую цитоархитектуру.

Все процедуры с животными соответствуют рекомендациям и были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Коннектикута не менее чем за два часа до вскрытия. Приготовьте вкладыши для культуры тканей в шести луночных планшетах к каждому. Добавьте один миллилитр среды для срезов культуры, затем перенесите планшеты в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом не менее чем за 15 минут до вскрытия.

Положите буфер для рассечения на лед и начните наполнять его 95% кислорода и 5% углекислого газа. Также убедитесь, что все инструменты и измельчитель тканей стерилизованы 70% этанолом. Перенесите ткань в стерильную 35-миллиметровую чашку, содержащую ледяной кислородный буфер для расслоений.

Затем с помощью лезвия бритвы разрежьте мозжечок и передний мозг, а затем сагиттальный разрез через передний мозг и мозжечок, разделяющий полушария. Теперь с помощью ручного измельчителя сделайте корональный и сагиттальный срезы толщиной 300 микрон четырех головного мозга и мозжечка. Каждое животное обычно дает шесть, четыре среза мозга и шесть срезов мозжечка.

В идеале берет срезы, охватывающие переднюю треть мозолистого тела, чтобы изучить как серую, так и белую области вещества в одном и том же срезе. Переложите отделенные ломтики в только что пузырчатый буфер для холодной дисперсии на льду в буфере с помощью небольшого шпателя для рассечения или взвешивания. Отделите отдельные секции и переведите их в предварительно инкубированные.

Шесть колодцев с культивирующими вставками. На одну культуру можно разместить два-три среза. Вставьте пипетку с поверхности культиватора излишки буфера для рассечения.

Вставьте и перенесите пластины в инкубатор до тех пор, пока они не будут зафиксированы. Среду для среза следует заменить через сутки после подготовки среза, а затем через день до фиксации среза, как указано в протоколе. В зависимости от эксперимента используйте срезы через пять-семь дней.

В культуре. Используйте только те срезы, которые становятся прозрачными после первых нескольких дней, и отбрасывайте те, которые имеют неровные непрозрачные участки, видимые невооруженным глазом. При контрастировании лица эти непрозрачные области выглядят как скопление темных клеток.

При правильном выполнении мертвые непрозрачные участки встречаются не более чем в одном-5% срезов. Для проведения покадровой визуализации пролиферации и дифференцировки двух клеток НГ используют срезы трех-пятидневной давности мышей, экспрессирующих EGFP в двух клетках НГ. Не позволяйте горкам опускаться ниже 37 градусов по Цельсию более 15 минут.

Во время сеанса визуализации, держа пластину закрытой, используйте 10-кратный объектив инвертированного флуоресцентного микроскопа для получения изображений в первый раз. Суть культуры. Сделайте изображение от четырех до восьми местоположений на каждом срезе из областей серого и белого вещества среза.

Кроме того, изобразите полезные ориентиры, такие как края срезов, конкретные клетки или ориентацию трактов белого вещества для целей переселения. Предыдущее изображение временной точки может быть использовано в качестве опорного изображения во время релокации для деления двух клеток НГ и дифференцировки олигодендроцитов. Делайте снимки каждые четыре-шесть часов в течение пяти-семи дней.

Если использовать индуцируемый маркер NG two cre, ER YFP, индуцировать экспрессию репортера с помощью питательной среды со 100 наномолярами. Четыре гидрокситамоксифена, растворенные в репортерной активности этанола, должны появиться в течение одного-двух дней. Для фиксации добавьте один миллилитр фиксатора на дно культуры.

Вставляем и добавляем еще один миллилитр поверх ломтиков. Не распыляйте фиксатор непосредственно на ломтики, иначе они могут отслоиться. Зафиксируйте ткань на 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия и затем с помощью скальпеля.

Вырежьте мембраны с прикрепленными ломтиками. С помощью пинцета аккуратно переложите срезы в отдельные лунки на 24 лунки планшета, загруженного PBS. Затем переложите срезы во второй 24-луночный планшет, загруженный блокирующим раствором, содержащим 5% обычной козьей сыворотки и 0,1% триттона X 100 в PBS.

Дайте им поинкубироваться в блокирующем растворе в течение часа при комнатной температуре. После блокировки переместите срезы на планшет, загруженный первичным антителом в PBS с 5% NGS. Дайте им инкубироваться в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Промойте ломтики в PBS. Затем инкубируйте срезы со вторичными антителами в PBS с 5% NGS. Дайте инкубации идти в течение одного часа при комнатной температуре.

После этого сделайте еще три промывки в PBS, как и раньше, и установите срезы мембраной лицом к предметному стеклу так, чтобы она не оказалась между объективом и тканью. Для анализа временной динамики дифференцировки олигодендроцитов были получены изображения деления двух клеток NG из культур среза переднего мозга от трансгенных мышей P 8 NG two creeg в течение нескольких дней, покадровые последовательности были взяты в течение 122 часов. Фенотип разделенных клеток определяли с помощью антител к NG two и CC one.

Пролиферацию клеток также оценивали с помощью иммуногистохимического окрашивания маркера пролиферации клеток. Картирование двух клеток НГ методом KI 67 проводилось после индукции рекомбинации CRE в срезах двух мышей CRE YFP. Через два дня после добавления четырех гидрокси тамоксифена.

Репортер YFP, экспрессирующий NG, был обнаружен в культурах с двумя положительными клетками. Четыре дня спустя часть этих клеток дифференцировалась в CC 1 положительные олигодендроциты цитов. Зрелые олигодендроциты были визуализированы в культурах срезов мозжечка из P-L-P-D-S.

У красных мышей миелинизированные нейроны Перкина присутствовали в этих культурах. Повторная визуализация показала добавление миелинизирующих DS красных, экспрессирующих олигодендроциты, иммунохимический анализ в этих срезах показал значительную экспрессию основного белка миелина. Наконец, визуализация с более высоким временным разрешением показала стабильные олигодендроцитарные клеточные тела с некоторыми незначительными движениями в дистальных отростках.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить культуры срезов как из четырех головного мозга, так и из мозжечка, многократно визуализировать отдельные клетки в течение нескольких дней или часов и анализировать судьбу клеток изображения с помощью иммуногистохимии. В дополнение к визуализации, эти срезы также позволяют манипулировать клеточной средой с использованием методов картирования судьбы, таких как индуцируемая рекомбинация сливок в подготовленном ломтике.