Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии

Общая цель этой процедуры заключается в сборе урожая Olink Glycans. Это достигается путем предварительного разрешения гликопротеинов на странице SDS. Вторым этапом является промывка кусочков геля, содержащих интересующий вас гликопротеин.

Затем олинк-гликаны высвобождаются путем восстановительного бета-элиминации. Заключительным этапом является метилирование гликана с разделением фаз. В конечном счете, пермированные метилированные гликаны анализируются с помощью тандемной масс-спектрометрии для обнаружения структур и количественной оценки распространенности.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография, заключается в том, что наш метод разделяет нейтральные и заряженные на метилированные гликаны в быстром фазовом разделении. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области науки о глико, позволяя всесторонне охарактеризовать или связать гликаны, высвобождаемые из разрешенных гликопротеинов. Перед началом этой процедуры рассосите гликопротеины с помощью гель-электрофореза.

После электрофореза поместите гель на стеклянную пластину и иссеките интересующую область с помощью чистого скальпеля, чтобы увеличить выход гликанов OG. Перенесите интересующую гелевую полосу на другую стеклянную пластину и разрежьте кусок примерно на два миллиметровых кубика. Переложите мелкие кусочки геля в стеклянную трубку размером 13 на 100 миллиметров с завинчивающейся крышкой с помощью микрошпателя из нержавеющей стали.

Далее добавьте в пробирку с образцом один миллилитр 25 миллимолярного бикарбоната аммония или амби. После того, как тюбик закрыт завинчивающейся крышкой с тефлоновой линией, аккуратно перемешайте содержимое, переворачивая тюбик, прежде чем дать ему постоять 10 минут. Затем осторожно извлеките амбит из стеклянной трубки.

С помощью пастбища или стеклянной пипетки добавьте в стеклянную пробирку один миллилитр ацетонитрила, чтобы полностью покрыть кусочки геля. После закрытия тюбика аккуратно перемешайте содержимое, переворачивая тюбик, прежде чем дать ему постоять 10 минут. Когда закончите, извлеките ацетонитрил из стеклянной трубки.

Повторив предыдущие действия до устранения ярко-синего цвета, добавьте два миллилитра этилацетата и закупорьте тюбик. Поместите пробирку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь с перемешиванием из конца в конец. После того, как этилацетат будет удален, выполните три промывки двумя миллилитрами деионизированной воды.

После того, как кусочки геля высохнут, добавьте 500 микролитров 100 миллимолярного раствора гидроксида натрия. И давайте постоим три-пять минут на льду, чтобы сбалансировать гель до основных условий, которые улучшают восстановление гликанов. После этого добавьте 500 микролитров двух молярных борогидридов натрия в 100 миллимолярных гидроксидах натрия, в результате чего в 100 миллимолярах гидроксид натрия будут получены конечные концентрации одного молярного борогидрида натрия в 100 миллимолярных гидроксидах натрия.

Аккуратно перемешав пробирку, инкубируйте образец при температуре 45 градусов Цельсия в течение 18 часов. В течение первого часа инкубации осторожно перемешивайте пробирку каждые 15 минут. После того, как реакция бета-элиминации будет завершена и пробирка будет помещена на лед, медленно добавьте 10% уксусной кислоты по каплям.

Чтобы нейтрализовать основание, аккуратно сделайте вихревую пробирку для образца между добавлениями уксусной кислоты, центрифугируйте пробирку для устранения пузырьков и предотвращения перелива при необходимости. Чтобы сделать небольшую стеклянную колонку, поцарапайте и сломайте кончик пастбищной или стеклянной пипетки с помощью керамического резака так, чтобы длина конуса пипетки составляла примерно один сантиметр. Раздразнив пробку из стекловаты, протолкните ее к кончику, образуя опору для смоляного слоя.

Закрепите колонку для дозатора прищепкой и поместите ее на стеклянную пробирку. Далее промойте пустую пипетку, содержащую стекловату, одним миллилитром метанола и тремя миллилитрами 5%-ной уксусной кислоты. После закручивания Dow X из водородной катионобменной смолы суспензию в 5% уксусной кислоте.

Переведите его в достаточном количестве, чтобы получить один миллилитр объема слоя в пастбищную пипетку, промывайте колонку пятью объемами 5%-ной уксусной кислоты, проверяя протекание на предмет появления смоляных частиц. После установки колонки на новую стеклянную трубку размером 16 на 125 миллиметров с завинчивающейся крышкой, загрузите образец на колонну. После того, как поток будет собран, выведите гликаны не менее чем с тремя объемами 5%-ной уксусной кислоты в ту же пробирку.

После лиофилизации добавьте 300 микролитров 10%-ной уксусной кислоты в метаноле в высушенную пробирку с образцом. После завивки удалите образовавшийся триметилбат путем выпаривания под струей азота при температуре 37 градусов Цельсия. После повторения стадий ресуспендирования и сушки не менее четырех раз восстановите образец в 5%-ной уксусной кислоте.

После того, как образец был загружен в уравновешенную колонну C 18, соберите поток в стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой размером 13 на 100 мм. Разбавьте OOG гликаны тремя миллилитрами 5%-ной уксусной кислоты в той же пробирке. Затем лиофилизируйте образец, чтобы получить базовый реагент для метилирования химической завивки.

Добавьте 400 микролитров 50% гидроксида натрия в чистую стеклянную трубку размером 13 на 100 миллиметров. Затем добавьте в ту же трубку 800 микролитров безводного метанола. Добавьте четыре миллилитра безводного оксида диметилсульфа и сделайте вихрь, чтобы получить белый осадок.

Центрифугируйте образец при 600-кратном перегрузке в течение одной минуты, чтобы окатыть осадок. Отбросив надосадочную жидкость и добавив в гранулу четыре миллилитра безводного оксида диметилсульфа, реагент повторить еще четыре раза, пока основная суспензия не станет полупрозрачной. Растворите гранулированную основу в трех миллилитрах безводного оксида диметилсульфа и аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз чистой пастбищной пипеткой.

Далее добавьте в высушенный образец 200 микролитров безводного оксида диметилсульфа и сделайте вихрь. Чтобы восстановить суспензию, добавьте в образец 300 микролитров ресуспензионной базовой суспензии и сразу же добавьте 100 микролитров метана ITOM. Запечатайте тюбик крышкой с тефлоновой подкладкой и энергично перемешивайте в течение пяти минут вихрем.

Чтобы остановить реакцию перманентного метилирования, поместите трубку на лед и добавьте два миллилитра 5%-ной уксусной кислоты. После вортексирования пять раз подайте раствор пипеткой вверх и вниз, чтобы уменьшить оставшийся объем метана ITOM за счет испарения. На этом этапе добавьте два миллилитра дихлорметана в образец после вихревого и центрифугирования.

Перенесите верхний водный слой в новую стеклянную трубку размером 13 на 100 миллиметров. После повторения водной промывки слоя дихлорметана соедините вторую водную фазу с первым водным слоем. После того, как промывка водой фазы дихлорметана повторится два-три раза, перенесите фазу дихлорметана в чистую стеклянную пробирку с помощью чистой пастбищной пипетки.

Затем высушите органическую фазу под струей азота при температуре 42 градуса Цельсия. После этого уравновешиваем колонну C 18 и загружаем на нее водный слой. Промойте колонку C 18 водой, а затем выведите пермированные метилированные сульфатированные o гликаны в новую стеклянную пробирку с двумя миллилитрами 50% метилированных OG гликанов Aceto Nitrile путем прямой инфузии в соответствующий масс-спектрометр с использованием нано-электро распыляемого источника со скоростью потока шприца от 0,4 до 0,6 микролитров в минуту при температуре 210 градусов Цельсия.

Капиллярная температура для фрагментации в результате диссоциации, вызванной столкновением, в МСМ S и многомерной МС прибора с ионной ловушкой применяет от 30 до 40% энергии столкновения репрезентативных масс-спектров образцов метилированного олинкгликана пермого олинк, высвобождаемых из бычьего муцина с использованием индуктивной бета-элиминации ингеля, показаны здесь на верхней панели. В спектрах преобладает полидисперсное загрязнение, полученное из полиакриламидного геля. Нижняя панель демонстрирует, что промывка кусочков геля этилацетатом перед бета-элиминацией устраняет эту проблему.

Оканные гликаны высвобождались из бычьего субверхнечелюстного муцина путем редуктивной бета-элиминации Ингеля с использованием кусочков геля, которые были нарезаны мелкими или крупными ломтиками. Извлечение оканов из мелких кусочков геля было почти в десять раз больше, чем из крупных срезов геля. Нейтральные пермированные метилированные гликаны восстанавливаются в органической дихлорметановой фазе.

В то время как в эфире метилированные гликаны количественно разделяются на водную фазу. Эффективность и простота метода фазового разделения значительно облегчает пропускную способность образцов и последующие аналитические подходы. Несульфатированные пермированные метилированные О-гликаны были выделены из органической фазы, а все пермированные метилированные сульфаликаны были выделены из водной фазы, что облегчает идентификацию и характеристику почти изобар сульфатированных и несульфатированных гликанов.

Эти гликаны отличаются всего на 0,1 единицы массы, и их было бы трудно определить без физического разделения двух видов с помощью фазового разделения после их развития. Этот метод позволил тщательно изучить разнообразие гликанов в образцах тканей, культивируемых клетках, модельных системах и образцах пациентов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно пальчато и разделять все связанные гликаны, высвобождаемые из глиевых белков.

Решено на странице SDS.