Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии
20 ноября 2014 г.
Чтобы всесторонне исследовать разнообразие О-связанных гликанов, новая процедура восстановления β в геле в сочетании с перметилированием и методом быстрого разделения фаз применяется к анализу О-связанных гликанов, непосредственно высвобождаемых из гликопротеинов, разрешенных с помощью SDS-PAGE и поддающихся последующему гликомическому анализу с помощью масс-спектрометрии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена новая методика анализа O-связанных гликанов, выделенных из гликопротеинов. Метод включает электрофорез в ПААГ с SDS для разделения белков с последующим восстановительным бета-элиминированием и перметилированием, завершаясь масс-спектрометрическим анализом.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Гликобиология
- Масс-спектрометрия
- Биохимия
Теоретические сведения
- O-гликаны играют важнейшую роль в различных биологических процессах.
- Понимание их разнообразия необходимо для изучения функций гликопротеинов.
- Традиционные методы могут быть недостаточно эффективны для анализа этих гликанов.
- В данном исследовании представлен оптимизированный подход к их анализу.
Цель исследования
- Разработать комплексный метод выделения O-связанных гликанов.
- Повысить эффективность гликомного анализа.
- Обеспечить возможность обнаружения и количественного определения структур гликанов.
Используемые методы
- Разделение гликопротеинов методом SDS-PAGE.
- Промывка фрагментов геля, содержащих целевые гликопротеины.
- Высвобождение O-связанных гликанов путем восстановительного бета-элиминирования.
- Перметилирование гликанов с последующим фазовым разделением.
Основные результаты
- Успешное высвобождение и анализ O-связанных гликанов.
- Идентификация структур гликанов с помощью тандемной масс-спектрометрии.
- Достигнуто количественное определение содержания гликанов.
- Метод демонстрирует повышенную эффективность по сравнению с традиционными подходами.
Выводы
- Новая процедура позволяет эффективно анализировать O-связанные гликаны.
- Она представляет собой ценный инструмент для гликомных исследований.
- Будущие применения могут расширить понимание функций гликопротеинов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный рабочий процесс обеспечивает комплексный анализ O-гликозилирования и сульфогликомики гликопротеинов, разделенных методом SDS-PAGE, что позволяет устранить основное препятствие при характеристике гликопротеинов для валидации мишеней. Путем удаления загрязнителей, вымываемых из геля, и повышения чувствительности обнаружения сульфатированных гликанов, данный метод повышает качество данных для снижения механистических рисков на ранних этапах поиска. Метод обеспечивает воспроизводимое высвобождение и количественное определение гликанов, что способствует идентификации ведущих соединений и выбору доклинических моделей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать гетерогенность O-гликанов в разделенных гликопротеинах для уточнения взаимосвязи «структура — функция» терапевтических мишеней.
- Практическая ценность: обеспечивает эффективное высвобождение гликанов посредством восстановительного β-элиминирования непосредственно в геле, что снижает потери образца и повышает степень извлечения по сравнению с методами с использованием вырезания фрагментов геля.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать очищенные O-гликаны, пригодные для последующего скрининга методом масс-спектрометрии, без загрязнений полиакриламидом, которые препятствуют детектированию.
- Практическая ценность: Устраняет необходимость в промежуточной очистке с помощью ВЭЖХ, что оптимизирует рабочий процесс и увеличивает пропускную способность конвейеров анализа гликанов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает обнаружение и характеристику сульфатированных гликанов за счет улучшенного фазового разделения, что позволяет проводить сульфогликомный анализ гликопротеинов, имеющих значение при заболеваниях.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение количественных данных о содержании гликанов с помощью тандемной МС, что способствует сопоставлению биомаркеров и принятию обоснованных решений о продвижении исследований с учетом рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий процесс исследования: от разделения гликопротеинов (SDS-PAGE) до высвобождения гликанов, их очистки, перметилирования и МС-анализа, что обеспечивает поддержку стадий идентификации ведущих соединений и доклинической валидации.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая комплексное профилирование O-гликанов из разделенных белковых полос для уточнения биологии мишени.
- Скрининг: позволяет получать образцы гликанов без примесей для надежного скрининга на основе MS и структурной характеристики.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение содержания гликанов и получение структурных данных с помощью тандемной MS для сравнения гликоформ при различных условиях.
- Трансляционные исследования: позволяет проводить сульфогликомный анализ гликопротеинов, связывая изменения гликанов с механизмами заболеваний и потенциалом биомаркеров.
- Масштабируемое применение: устанавливает стандартизированный, многократно используемый рабочий процесс анализа гликанов, применимый к различным мишеням-гликопротеинам и типам образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет обеспечения всесторонней характеристики гликанов, что снижает неопределенность в понимании механизмов функционирования гликопротеинов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря надежной промывке геля и простым процедурам очистки, что сводит к минимуму вариабельность между партиями.
- Стратегическая ценность: способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя высококачественные данные о гликанах, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ, нацеленных на гликопротеины.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков на основе количественных данных о гликанах, которые отражают взаимодействие с мишенью и модуляцию путей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области гликобиологии, проведения SDS-PAGE и методов химического высвобождения гликанов.
- Необходимо стандартное лабораторное оборудование, включая стеклянные пробирки с винтовыми крышками, микроцентрифужные пробирки, центрифугу, вортекс, а также доступ к масс-спектрометрии.
- Требуется стандартизация этапов промывки геля, инкубации для β-элиминирования и фазового разделения для всех пользователей и лабораторий.
- При адаптации метода следует учитывать оптимизацию в зависимости от содержания гликопротеинов, размера фрагмента геля и уровня сульфатирования гликанов.
- Практические ограничения включают 18-часовой период инкубации для β-элиминирования и этапы ручного манипулирования, которые могут препятствовать полной автоматизации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Gel Excision and Removal of Gel-derived Contaminants
3:14
In-gel O-glycan Release by Reductive β-Elimination and Desalting on Cation-exchange Chromatography
6:02
Borate Removal, C18 Clean-up and Base Preparation for Permethylation
8:03
Permethylation of Released Glycans C18 Clean-up and Mass Spectrometry Analysis
10:33
Results: Recovery and Mass Spectral Analysis of Permethylated O-linked Glycans
12:30
Conclusion
