Экстракорпоральное возобновлении деятельности светособирающих комплексов растений и зеленых водорослей

Общая цель данного эксперимента заключается в воссоздании in vitro светособирающих пигментных белковых комплексов растений или водорослей. Это достигается за счет извлечения пигментов из листьев шпината или культур водорослей, а также чрезмерной экспрессии протеза APA в кишечной палочке. На втором этапе проте APA смешивают с пигментами для получения восстановленного комплекса.

Затем восстановленный пигментный белковый комплекс очищают от избытка пигментов и получают результаты развертки белка, которые демонстрируют схожие спектроскопические характеристики восстановленного пигментного белкового комплекса и нативного комплекса на основе спектров поглощения, флуоресцентных спектров и кругового деизма. Основным преимуществом данной процедуры является то, что она позволяет получить относительно большое количество пигментных белковых комплексов, а также манипулировать комплексами с использованием в мутировавшем типе белковых и пигментных смесей с различным составом. С помощью блендера гомогенизируйте горсть шпината, оставьте примерно 20 грамм в 100 миллилитрах буфера холодного помола на 20 секунд.

Отфильтруйте раствор через два слоя нейлоновой ткани с плохим диаметром 20 микрометров и центрифугируйте фильтрат при давлении 1 500 G в течение 10 минут. При четырех градусах по Цельсию. Снимите надосадочную жидкость и добавьте один миллилитр буфера для холодной стирки.

Суспендируйте гранулу, содержащую хлоропласты, мягкой кистью художника. Как только гранула будет ресуспендирована, добавьте 50 миллилитров промывки, буфера и центрифуги, раствор в 10 000 г на 10 минут. При четырех градусах Цельсия удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте гранулу в 50 миллилитрах промывочной буферной центрифуги, растворе при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, с этого момента полностью удалите надосадочную жидкость.

Эту процедуру необходимо выполнять в темное время суток. Чтобы избежать окисления пигмента, добавьте примерно 20 миллилитров 80% ацетона, буферизованного карбонатом натрия, чтобы извлечь пигменты, оставьте раствор на льду на 10 минут. Время от времени вихревая подошва клеточных компонентов путем центрифугирования при 12 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Общая экстракция пигмента должна привести к получению белой гранулы. Соберите снат в разделительную воронку. Добавьте 0,4 объема датилэфира.

Энергично встряхните и обязательно откройте клапаны, чтобы выпустить газ. Добавьте 0,8 объема пункта 33 моляра натрия хлорида и энергично перемешайте. Подождите примерно 10 минут, чтобы слои разделились.

Эфирная фаза сверху содержит извлеченные пигменты. Удалите и выбросьте прозрачную нижнюю фазу. Удалите эфир, перелив его с верхней части разделительной воронки в подходящую стеклянную емкость.

Высушите эфир, добавив ложку гранулированного безводного сульфата натрия. Взбейте раствор и дайте примерно пять минут, чтобы адсорбент впитал воду из эфира. Когда эфир достаточно высохнет.

Должно быть некоторое количество свободно плавающих кристаллов и не должно быть комкования сульфата натрия. Сцедите эфир в новую стеклянную емкость, оставив твердое вещество сульфата натрия после аликвоты пигментов, и высушите их в вакууме с вращающейся скоростью до полного испарения ацетона. Храните высушенные пигменты при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Извлечение кератиноида из шпината в этом видео не показано, но высушенные пигменты также хранятся при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Светособирающий комплекс или БАК для восстановления экспрессировали и очищали от кишечной палочки в виде тел включения. Для успеха восстановления решающее значение имеет соотношение между пигментными белками и количеством используемого буфера.

Эту процедуру следует выполнять при слабом освещении. Ресуспендировать 800 микрограммов включений LHC в общей сложности 400 микролитров te. В двухмиллилитровую пробирку добавьте 400 микролитров двух x восстановителей, буфера и вихря.

Кратковременно добавьте 0,6 микролитра 14,8 молярного бета-мара запаса этанола CAPTA. Чтобы получить конечную концентрацию в 10 миллимоляров, нагрейте белок при температуре 98 градусов Цельсия в течение одной минуты. Вортись ненадолго и поместить при комнатной температуре на три минуты.

Ресуспендируйте 500 микрограммов общего количества высушенных пигментов хлорофилла, а также 80 микрограммов кератиноидных пигментов в 30 микролитрах 100% этанола путем энергичного вортексирования. На одну минуту. Вращайте смесь пигментов при температуре 15 800 G при четырех градусах Цельсия в течение примерно 30 секунд и убедитесь, что гранул нет сразу после отжима, медленно добавляйте смесь пигментов к охлажденному белку во время вортекса.

Будьте осторожны и не делайте вихри слишком энергично, так как белок может переполнить верхнюю часть трубки. Продолжайте делать вихрь в течение пяти-10 секунд, а затем положите трубку на мокрый лед. Добавьте 94 микролитра 20% октала, бета-D глюкозида или og, чтобы получить конечную концентрацию 2% Vortex на короткое время, и держите на льду в течение 10 минут, добавьте 90 микролитров двух моляров хлорида калия, чтобы получить конечную концентрацию от 150 до 200 микромоляров.

Ненадолго перемешайте и оставьте на льду на 20 минут. Вращайте при температуре 15, 800 GS при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перенесите натант SUP в 10-миллилитровую трубку, не потревожив гранулу.

Хранить натин в холоде и в защищенном от света месте. Начните эту процедуру с подготовки колонки с никелевым СРО объемом один миллилитр, как описано в тексте протокола. Добавьте три-четыре миллилитра OG-буфера к образцу белка и загрузите образец в колонку.

Промойте колонку пятью миллилитрами буфера OG, а затем двумя миллилитрами буфера для полоскания OG. Разбавьте связанный белок тремя миллилитрами буфера элу. Соберите зеленый эллу, который содержит восстановленный белок.

Градиент сахарозы готовится, как описано в тексте протокола, тщательно удаляется из верхней части градиента, в том же объеме, что и у зеленой фракции, указанной в столбце с никелевыми СРО. Медленно загрузите восстановленный образец сверху, стараясь не нарушить градиент. Поместите трубку и весы в вращающийся ротор ковша S SW 41 или SW 60 и вращайте в ультрацентрифуге при давлении 200 000 G при четырех градусах Цельсия в течение 18 часов с медленным ускорением и остановкой без перерывов.

Когда ультрацентрифуга будет готова, с помощью щипцов осторожно вынимайте градиент из держателя пробирки. Зеленая полоса — это дробь, которую нужно собрать. Спектр поглощения CP 24.

Восстановленный in vitro белок, связывающий хлорофилл AB, сравнивают со спектром нативного комплекса. Идентичные спектры указывают на практически идентичный состав и организацию пигмента. Качество восстановленного комплекса также можно оценить с помощью флуоресцентной спектроскопии.

Поскольку пигменты излучают флуоресценцию при возбуждении на разных длинах волн, хлорофилл А на 440 нанометрах хлорофилл B на 475 нанометрах и зилы на 500 нанометрах. Спектры флуоресцентного излучения восстановленного комплекса дикого типа CP 24 и нормализованные до максимума показывают эффективный перенос энергии от хлорофилла B и наполнителей XANTHE к хлорофиллу A. Присутствие хлорофилла B, не скоординированного с белком, можно распознать по дополнительному плечу около 650 нанометров. Присутствие свободного хлорофилла А приводит к дополнительному излучению около 675 нанометров.

Спектры флуоресцентного излучения на 475 нанометрах как восстановленного, так и нативного комплексов CP 24 показывают один пик на 681 нанометре, что указывает на то, что восстановленный комплекс правильно свернут. Восстановленный CP 24 и нативный комплекс также демонстрируют очень похожие круговые спектры харизмы. Остатки отдельных аминокислот, важные для координации различных пигментов, могут быть изменены для анализа свойств отдельных пигментов или оценки их вклада в функцию и стабильность комплекса.

Здесь показаны спектры поглощения дикого типа и мутировавшего CP 29. Зеленая линия показывает различия между двумя графиками При использовании этого метода, включая градиент SUSE, ультрацентрифугирование может быть выполнено за 24 часа, если оно выполнено правильно.