Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного In Vitro Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Общая цель этого эксперимента заключается в создании неклеточной искусственной антигенпрезентирующей клетки-киллера на основе HLA IG, или K-A-A-P-C для истощения аутореактивных или нежелательных популяций Т-клеток. Это достигается путем первого ковалентного связывания молекул HLA IG и моноклональных антител Antifa с частицами железа размером с клетку для получения функционального K-A-A-P-C На втором этапе K-A-A-P-C характеризуются проточной цитометрией, чтобы обеспечить их надлежащую функциональность. Затем K-A-A-P-C загружаются различными пептидами, представляющими интерес, для нацеливания на нежелательную антиген-специфическую популяцию Т-клеток.

В конечном счете, проточный цитрический анализ может быть выполнен для измерения антиген-специфического антижирового опосредованного уничтожения Т-клеток родственной загрузкой. К-А-А--К. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы столкнулись с проблемами при разработке клетки, представляющей антиген киллера, в то время как мы, в то же время, работали над разработкой платформы на основе битов. Технология модуляции иммунных клеток Чтобы сначала получить K-A-A-P-C, добавьте 250 микролитров эпоксидных гранул из бульона и 250 микролитров свежеприготовленного буфера из боратов в стерильный стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой.

Поместите флакон на магнит, чтобы шарики прилипли через две минуты, втяните буфер и снимите флакон с магнита. Промойте шарики один раз еще одним миллилитром отверстия восьмерки буфера, а затем повторно суспендируйте их в 550 микролитрах HLA A two IG и античеловеческом CD 95 MAB. Осторожно встряхните флакон, чтобы смешать шарики с антителами, а затем инкубируйте шарики на вращателе из конца в конец при четырех градусах Цельсия в течение 24 часов.

На следующий день убавьте бусины в течение двух минут при температуре 300 G и комнатной температуре и поместите флакон обратно на магнит. Через две минуты откачайте загрузочный буфер. Снимите флакон с магнита и промойте шарики в одном миллилитре буфера для стирки с тщательным встряхиванием.

После третьей промывки поверните флакон в одном миллилитре буфера для промывки свежих шариков, чтобы заблокировать любые остаточные участки связывания белка. На следующий день снова поверните бусины вниз и поместите флакон обратно на магнит. Через две минуты отсасывайте буфер для стирки.

Снимите флакон с магнита и добавьте в KAPC один миллилитр PBS. Чтобы проверить качество бусин, переложите 1,5 раза по 10 в пятую часть K-A-A-P-C в трубку для факса и промойте их одним миллилитром буфера для промывки факса Resus. Суспендируйте гранулу гранул в 100 микролитрах промывочного буфера и добавьте один микролитр антимышиного IgG одного PE для обнаружения HLA A, двух IG и один микролитр антимышиного IG MFI TC для обнаружения античеловеческого CD 95 MAB.

Затем после 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия промойте шарики в одном миллилитре буфера для промывки факса Resus. Суспензируйте их в 250 микролитрах промывочного буфера и считайте образцы на проточном цитометре на предмет пептидной загрузки. Переложите два раза по 10 до седьмой части K-A-A-P-C в новый стерильный стеклянный флакон.

Затем, поместив бусины на магнит на две минуты, аспирируйте PBS и повторно суспендируйте бусины в 500 микролитрах свежего PBS, содержащем пять микрограммов пептида. Наклейте на флакон этикетку с указанием даты и названия загруженного пептида, K-A-A-P-C. Затем храните загруженный K-A-A-P-C при температуре 4 градуса Цельсия в течение не менее трех дней, чтобы обеспечить достаточную нагрузку пептида на димер HLA A 2-IG для проведения анализа на уничтожение A-K-A-A-P-C in vitro.

Промойте пептид K-A-A-P-C, как показано на рисунке, не менее шести раз, чтобы удалить весь свободный пептид. Затем перенесите K-A-A-P-C и дважды по 10 до пятого антиген-специфических Т-клеток в одну лунку на образец 96-луночного круглого дна в 200 микролитрах сокультуральной среды в соотношении один к одному после 48 часов культивирования в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Перенесите образцы в соответствующие факсимильные трубки и промойте их в одном миллилитре связывающего буфера nexin five.

Затем повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах связывающего буфера nexin five, а затем инкубируйте образцы в одном микролитре nexin five FITC и пяти микролитрах семи a d при комнатной температуре. Через 10-15 минут промойте образцы одним миллилитром связывающего буфера nin five и повторно суспендируйте гранулы в 250 микролитрах связывающего буфера nin five. Затем сразу же считывают образцы на проточном цитометре.

K-A-A-P-C одновременно отображает HLA, A, два IG и Antifa MAB, что, по сравнению с клеточными подходами, не изменяется за счет кодирования или эффективности трансдукции и может быть легко модулировано во время производства. K-A-A-P-C способны истощать антиген-специфические Т-клетки in vitro при загрузке родственным пептидом, в то время как при неродственной нагрузке. K-A-A-P-C не истощают Т-клетки, поэтому K-A-A-P-C индуцирует апоптоз Т-клеток антиген-специфическим образом.

Впоследствии, когда K-A-A-P-C используются для селективного истощения антиген-специфических Т-клеток только из смеси различной специфичности Т-клеток, минимальная цитотоксичность проникает в соседние Т-клетки. Таким образом, K-A-A-P-C представляют собой изысканное средство для in vitro, антиген-специфического истощения активированных антиген-специфических Т-клеток человека с потенциальной клинической применимостью для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения аллотрансплантата после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной иммунологии к изучению новых подходов к лечению Т-клеточных аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата.