Использование микромасштабных кремниевые зонды для оценки Сотовый сократительной функции In Vitro
3 октября 2014 г.
Этот протокол описывает использование микромасштабных кремниевых кантилеверов, гибких культуры поверхностей для измерения сократимость мышечных клеток в пробирке. Сотовый сокращение вызывает изгиба кантилевера, которое может быть измерено, записанного, и превращается в считываниями силы, обеспечивая неинвазивный и масштабируемую систему для измерения сократительной функции в пробирке.
Целью данного эксперимента является измерение сократительной активности культивируемых мышечных волокон в ответ на стимуляцию в контролируемой среде in vitro. Это достигается путем нанесения диссоциированных мышечных клеток на микромасштабные кремниевые консоли и индуцирования слияния этих одноядерных клеток с образованием волокон, называемых миотрубками. Эти кантилеверные чипы, поддерживающие дифференцированные мышечные клетки, затем переносятся в электрофизиологический микроскоп, модифицированный для поддержки лазера и фотодетектора, используемого для измерения прогиба кантилевера в ответ на сокращение мышц после размещения чипа в установке.
Лазер расположен таким образом, что он фокусируется на кончике кантилевера, а фотодетектор также настроен таким образом, чтобы улавливать отклоненный луч Получены результаты, которые показывают степень отклонения кантилевера, которое вызвано сокращением мышц в ответ на электрическую или химическую обработку, обеспечивая прямое измерение профиля сокращения засеянных клеток в режиме реального времени. В конечном счете, консольное смещение может быть обработано для обеспечения считывания силы. Эта система мультиплексирована, чтобы обеспечить потенциально высокопроизводительный испытательный стенд для оценки изменений сократительной функции в ответ на медикаментозное лечение, заболевание, состояние или протоколы физических упражнений.
Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как электрофизиология с патч-зажимом, заключается в том, что этот метод функционального анализа является неинвазивным и легко адаптируется для высокопроизводительных исследований. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарств, такие как определение соответствующих концентраций реакции на дозу до клинической оценки. Применение этого метода распространяется на терапию множественных мышечных заболеваний, поскольку он предоставляет средства для исследования функциональной производительности клеток из различных патологических фенотипов В режиме реального времени, однако, этот метод может дать представление о скелетных мышечных патологиях.
Его также можно использовать для других тканевых систем, таких как сердечные и гладкие мышцы Стерилизованные, предварительно подготовленные стружки кантилевера и крышки 13 F в 70% растворе этанола и дайте высохнуть на воздухе в проточном колпаке. Затем поместите отдельные консольные стружки поверх защитных колпачков 13 F. Внутри стандартного 12-луночного планшета нанесите покрытие на консоли биополимером или модификацией поверхности, оптимизированной для используемого типа клеток Согласно стандартным протоколам культивирования клеток, поверхностное покрытие занимает 30 минут при использовании нашего метода подготовки, но может быть изменено в зависимости от конкретного протокола культивирования исследователя.
Риз поместил клетки в их специфическую питательную среду в желаемую концентрацию, затем сотни микролитров клеточной суспензии на поверхность кантилевера чипа, гарантируя, что пузырь среды полностью покроет консольные окна. Перенесите планшет с чипсами в инкубатор и дайте ячейкам прилипнуть в течение как минимум одного часа после этого периода покрытия. С помощью стерильных щипцов перенесите чип в чистую лунку без защитного стекла 13 F и добавьте в каждый по одному миллилитру питательной среды.
Хорошо верните планшет в инкубатор, поддерживайте клетки по их стандартному протоколу для поддержания in vitro. На покровные листы поместите нагретую чашку для культуры на столик вертикального электрофизиологического микроскопа. Добавьте в нагретый микроскоп три миллилитра имеющейся клеточной питательной среды.
Установите электроды из нержавеющей стали на внутренней стороне нагреваемой чашки для культуры на расстоянии 15 миллиметров. Подключите их к генератору импульсов, способному производить полевую стимуляцию, импульсы различной интенсивности, частоты и формы волны, чтобы система могла производить полевую стимуляцию клеток, когда это необходимо. Прикрутите гелий-неоновый лазер, установленный на поступательных столиках XY, к нижней стороне стола микроскопа.
Затем отрегулируйте лазер таким образом, чтобы лазерный луч был направлен через основание нагреваемой чашки для культуры под углом 30 градусов относительно плоскости консоли. Следующий болт — модуль квадрантного фотоприемника, установленный на поступательных столиках XY в нижней части предметного столика микроскопа. Отрегулируйте его положение так, чтобы отраженный лазерный луч попадал в центр четырех квадрантов.
Напишите программное обеспечение для управления линейными приводами, которые сканируют консоли со ссылкой на блок-схему, представленную в текстовом протоколе. Включите оборудование для анализа кантилевера и соответствующее программное обеспечение. Вставьте нагретый столик в среду и подождите, пока он покажет 37 градусов по Цельсию.
Затем вставьте консольный чип в столик так, чтобы консоли были ориентированы на правую сторону предмета. Включите источник света микроскопа. Сфокусируйте микроскоп так, чтобы увидеть края консолей, и используйте программное обеспечение для управления лазерным фотодетектором, чтобы расположить лазерный луч на кончике консольного консоли, предполагая, что кантилеверы ориентированы вправо от консоли предметного столика.
Один из них расположен в верхнем левом углу массива, а числа уменьшаются до 16. В левом нижнем углу. Консоль 17 находится в верхнем правом положении и идет до 32.
В правом нижнем углу нажмите кнопку воспроизведения в программном обеспечении для записи. Расположите фотодетектор так, чтобы сигнал показывал ноль в обоих кадрах x и y, отрегулировав шаговые двигатели, управляющие фотодетектором. Затем установите консоль в одно положение в программном обеспечении для управления лазерным фотоприемником.
Далее переместите лазер на кончик консоли 16. Повторите позиционирование фотодетектора и установите положение консоли на 16 градусов в программном обеспечении для управления лазерным фотодетектором. Теперь переместите лазер на кончик консоли 32.
Повторите позиционирование фотодетектора и установите положение кантилевера 32 в программном обеспечении для управления лазерным фотодетектором. Наконец, переместите лазер на кончик консоли 17. Повторите позиционирование фотоприемника и установите положение кантилевера 17 в программном обеспечении для управления лазерным фотоприемником.
Выключите источник света микроскопа, а затем верхний свет в лаборатории. Нажмите кнопку записи в программном обеспечении для записи. Установите аппаратное обеспечение генератора импульсов на 40 миллисекунд и пять вольтовых импульсов, частоту в один герц.
Затем включите аппарат Используя программное обеспечение для управления лазерным фотодетектором, настройте оборудование на сканирование по 32 консольным массивам. Останавливаясь на пять секунд у каждого. Когда сканирование 32 консолей будет завершено, выключите стимулятор.
Затем остановите программу записи и откройте файл данных. Изучите записанную кривую от каждой консоли. Для подтверждения сократительной активности.
Сокращение определяется как пик. Если прогиб по крайней мере на 0,1 вольта выше базовой линии, запишите каждый консоль с положительными откликами. Удалите все нереагирующие кантилеверы из протокола сканирования в программном обеспечении для управления лазерным фотодетектором.
Затем активные кантилеверы могут быть повторно отсканированы без стимуляции, чтобы получить показания спонтанной сократительной активности клетки. Затем добавьте в среду терапевтическое соединение, чтобы наблюдать за его влиянием на функциональный выход культивируемых клеток. После добавления составного прогона при сканировании с широким полем электростимуляции или без нее проводится оценка усталости путем электрической стимуляции клеток в течение длительных периодов времени, за которым следует сканирование уровней сократимости, чтобы измерить, сколько времени требуется для того, чтобы пиковая сила упала ниже определенного порога.
В экспериментах, в которых моторные нейроны поддерживаются в кокультуре с мышечными измерениями формирования нервно-мышечных соединений путем обработки моторных нейрокультур миотрубки кантилевера с помощью нейронального стимулятора или синаптического ингибитора и сканирования на предмет увеличения и уменьшения спонтанной активности, приступают к анализу данных об отклонении кантилевера, как подробно описано в текстовом протоколе. Успешное культивирование сократительных клеток на консолях является относительно простой процедурой с использованием стандартных методов культивирования клеток. Стандартное электрофизиологическое программное обеспечение может быть использовано для анализа исходных данных, облегчающих расчет соответствующих функциональных свойств, таких как время пиковой силы до пиковой силы и время до полурасслабления.
Протоколы расширенной стимуляции позволяют оценить уровень усталости в культивируемых клетках, тем самым расширяя уровень физиологических данных, получаемых с помощью этой системы. Кантилеверная система культивирования может быть модифицирована для включения моторных нейронов в систему культивирования с миотрубками скелетных мышц, чтобы обеспечить возможность оценки формирования нервно-мышечных синапсов in vitro. В таких культурах скорость спонтанной сократительной активности сравнивается со скоростью сокращения в ответ на лечение специфическим для нейронов стимулятором, таким как глутамат.
Любое наблюдаемое увеличение скорости сокращения, вызванное глутаматами, позволяет предположить активацию культивируемых нейронов, ведущую к высвобождению ацетилхолина и последующей активации миотрубки Лечение ингибиторами синапсов, такими как блокатор ацетилхолиновых рецепторов, dtu rine, которые приводят к прекращению индуцированной глутаматом активности, предоставляет дополнительные доказательства наличия функциональных нервно-мышечных синапсов в этих культурах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать микромасштабные кремниевые консоли для оценки функциональных свойств культивируемых скелетных мышц
.Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается использование кремниевых микрокантилеверов в качестве гибких поверхностей для культивирования с целью измерения сократимости мышечных клеток in vitro. Сокращение клеток вызывает изгиб кантилевера, который можно измерить и преобразовать в показатели силы, что обеспечивает неинвазивную систему оценки сократительной функции.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Мышечные волокна могут быть культивированы in vitro для экспериментального анализа.
- Микромасштабные консоли предоставляют новый метод измерения сокращения мышц.
- Измерение сократительной активности в режиме реального времени имеет решающее значение для понимания физиологии мышц.
- Данный метод позволяет проводить высокопроизводительное тестирование функции мышц.
Цель исследования
- Для измерения сократительной активности культивируемых мышечных волокон.
- Для оценки реакции мышечных клеток на электрическую или химическую стимуляцию.
- Для разработки масштабируемой системы оценки сократительной способности мышц.
Используемые методы
- Диссоциированные мышечные клетки высевают на кремниевые консоли микромасштаба.
- Клетки индуцируют к слиянию в миотрубки для измерения сократимости.
- Чипы с консолями помещают в электрофизиологический микроскоп, оснащенный лазером и фотодетектором.
- Измеряют отклонение консоли в ответ на сокращение мышц.
Основные результаты
- Результаты указывают на то, что степень отклонения консоли коррелирует с сокращением мышц.
- Данные в режиме реального времени позволяют получить представление о профиле сокращения мышечных клеток.
- Система позволяет проводить мультиплексную оценку сократительной функции.
- Потенциальные области применения включают оценку воздействия лекарственных препаратов и протоколов физических упражнений.
Выводы
- Данный метод предлагает неинвазивный подход к изучению сократимости мышц.
- Он обеспечивает платформу для высокопроизводительного анализа функции мышц.
- Полученные результаты могут способствовать пониманию физиологии и патологии мышц.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Микромасштабные системы с кремниевыми консолями позволяют проводить неинвазивное измерение сократительной функции клеток в режиме реального времени, предоставляя прогностическую платформу in vitro для оценки эффективности и токсичности лекарственных средств в мышечных тканях. Данный подход поддерживает валидацию мишеней и идентификацию ведущих соединений на ранних этапах за счет получения количественных, воспроизводимых данных о сократительных реакциях на фармакологические или генетические воздействия. Дизайн с мультиплексными массивами облегчает проведение скрининга со средней и высокой пропускной способностью, что улучшает сортировку портфеля препаратов и снижает биологические риски на поздних стадиях разработки терапевтических средств для нервно-мышечной, сердечной и гладкой мышечной тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения прямых функциональных ответов клеток скелетных, сердечных и гладких мышц в ответ на стимуляцию.
- Операционная ценность: способствует биологическому снижению рисков за счет точного безмаркерного количественного определения сократительной активности в качестве фенотипического показателя взаимодействия с мишенью.
- Прогностическая ценность: позволяет получать данные о зависимости «доза-эффект» и кинетические данные, которые используются для оптимизации ведущих соединений и принятия решений о переходе к доклиническим исследованиям.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые измерения сократимости на мультиплексных массивах консолей для согласованной оценки соединений.
- Масштабируемость: позволяет использовать протоколы средней и высокой пропускной способности для оценки вызванных препаратами изменений сократительной функции, что повышает эффективность кампаний по скринингу.
- Качество данных: обеспечивает считывание силы в режиме реального времени на основе прогиба, что снижает вариабельность и повышает достоверность зависимостей «структура — активность».
Трансляционные и доклинические исследования
- Моделирование заболеваний: позволяет оценивать сократительную дисфункцию в клетках с патологическими фенотипами, что способствует фенотипическому скринингу нейромускулярных и других мышечных заболеваний.
- Механистическое снижение рисков: облегчает оценку формирования нервно-мышечных соединений и взаимодействия между нейронами и мышцами в системах кокультивирования, что дает информацию для валидации механизмов воздействия мишеней.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от этапа поиска к доклинической валидации за счет возможности лонгитюдной оценки сократительной способности в условиях утомления, стимуляции или воздействия соединений.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Система консольных рычагов интегрируется в рабочий процесс поиска новых лекарств, начиная с ранней валидации мишеней и заканчивая идентификацией ведущих соединений и доклинической оценкой, предоставляя функциональную фенотипическую платформу, которая дополняет биохимические и генетические методы скрининга.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем установления связи между генетическими или фармакологическими воздействиями и измеримыми изменениями сократимости клеток.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет мультиплексного измерения отклонения, что позволяет проводить надежный скрининг библиотек соединений.
- Аналитика: Предоставляет количественные показатели, включая пиковую силу, время достижения пика и кинетику релаксации, что помогает сравнивать эффективность соединений и механизмы их действия.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают преемственность доклинических исследований за счет моделирования сократительных фенотипов, характерных для заболевания, и оценки терапевтического восстановления в моделях на основе мышечной ткани.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой многократно используемую, адаптируемую методику, применимую к различным типам мышечных клеток и моделям заболеваний, что сокращает затраты на повторную разработку анализов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет измерения функциональных физиологических конечных точек вместо суррогатных маркеров.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря автоматизированному детектированию отклонения лазерного луча и использованию форматов мультиплексных массивов.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннюю функциональную сортировку соединений, что снижает инвестиции в ложноположительные результаты.
- Влияние на портфель: поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, предоставляя понимание механизмов сократительной способности или эффективности до начала исследований in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, дифференцировкой мышц и микроскопией, совместимой с электрофизиологическими исследованиями.
- Работа зависит от лазерного и фотодетекторного оборудования, XY-трансляционных столиков и аппаратного обеспечения в виде генератора импульсов для стимуляции и измерений.
- Для получения воспроизводимых результатов в разных центрах необходима межгрупповая стандартизация протоколов посева клеток, покрытия поверхностей и стимуляции.
- Адаптация к различным типам мышечной ткани (скелетной, сердечной, гладкой) может потребовать оптимизации покрытий поверхностей и условий культивирования.
- Практические ограничения включают необходимость тщательной юстировки оптических компонентов и возможный дрейф сигнала при длительной записи, как отмечено в протоколе.
