Мини-этажном воздуха поднимается Платформа: Новый метод Объединение Поведение с микроскопии или электрофизиологии на Пробудитесь свободно движущейся Грызунов

Здравствуйте, меня зовут Хель Линь, я учусь в аспирантуре Научного центра Near при Хельсинкском университете. Сегодня мы с коллегами покажем вам, как проводить оптическую и электрофизиологическую регистрацию в бодрствующем состоянии головы, но при этом свободно передвигаться и вести себя животным. Наш метод создает осязаемую, знакомую среду для навигации и исследования мыши.

Во время микроскопической визуализации или электрофизиологической записи отдельных клеток, которые требуют прочной фиксации головы животного, мы имплантируем хроническое черепное окно и приучаем мышь к передвижной клетке для дома на колесах, которая скользит под ногами животного. Во время передвижения по плоской поверхности клетка мобильного дома может быть расположена под стандартным вертикальным микроскопом для двухфотонной визуализации или помещена в электрофизиологическую установку, предназначенную для записи с помощью патч-фикса в мозге мыши в состоянии бодрствования. Все представленные здесь экспериментальные процедуры одобрены местным комитетом по этике.

Мы имплантируем краниальные окна в соответствии с опубликованными протоколами с незначительными изменениями после имплантации краниальных окон. Животному дают возможность восстановиться в течение как минимум двух или трех недель в течение этого периода восстановления, окно обычно восстанавливает свою прозрачность. Из экспериментов исключаются животные с любыми признаками остаточного послеоперационного воспаления.

Обучите отобранных для исследования животных приучать их к фиксации головы. В клетке для передвижного дома спокойно держите мышь в течение 5-10 минут, избегая резких движений и шумов, а затем верните ее в домашнюю клетку. Повторите процедуру два или три раза с неравными интервалами.

Клетка для мобильного дома позволяет фиксировать голову без анестезии животного перед фиксацией головы. Используйте тряпку, чтобы обернуть мышь два или три раза с неравными интервалами. Убедитесь, что животное остается спокойным, когда укутано.

В противном случае повторяйте процедуру до тех пор, пока мышь полностью не привыкнет к ней. Начинайте дрессировку мышей два раза в день в клетке для мобильных домов на следующий день после завершения обработки. Взвешивайте животных перед каждой тренировкой.

Животные, демонстрирующие потерю веса более чем на 10%, должны быть исключены из исследования. Отрегулируйте положение руки для фиксации головы в соответствии с размерами дрессируемого животного. Подключите воздухозаборник устройства для клетки мобильного дома к стандартному лабораторному выпускному отверстию сжатого воздуха.

Убедитесь, что давление воздуха достаточно для свободной плавучести перевозимого по воздуху домашней клетки. Начните дрессировку привыкших животных в клетке для передвижного дома. Обездвижите мышь, завернув ее в тряпку.

Вставьте металлический держатель, прикрепленный к голове животного, в рычаг фиксации головы и прочно зафиксируйте его, затянув винтами. Включите поток воздуха, чтобы воздушная домашняя клетка левитировала. Снимите тряпку и позвольте мыши исследовать домашнюю клетку.

Во время первой тренировки мыши могут демонстрировать замирание и дрожь, а также эрекцию хвоста. Чтобы приучить животное к шуму, обеспечьте постоянное воздействие окружающих звуков с помощью, например, радиоперевода или записанной музыки и речи во время всех занятий, а также во время экспериментов. Чтобы избежать хронического стресса, используйте яркое освещение в течение первого часа тренировки.

После первого часа проводите дрессировку в темноте и используйте ближнюю инфракрасную камеру, чтобы следить за поведением животного. Когда тренировка будет завершена, освободите животное от фиксирующего рычага головы, потеряв винты. Верните животное обратно в домашнюю клетку не менее чем за два часа до следующей тренировки.

Содержание мыши в клетке с двумя или более другими мышами снизит уровень стресса. По желанию вы можете разместить перевозимую по воздуху клетку вместе с животным в его домашней клетке. Это обогатит окружающую среду и может усилить условия проживания животного в клетке для мобильного дома.

Во время последней тренировки мыши привыкли к фиксации головы и должны демонстрировать беззаботное поведение, спокойно перемещаясь по перевезенной по воздуху домашней клетке. В отсутствие видимого света траекторию передвижения мыши можно отследить, наблюдая за движениями клетки с помощью камеры ближнего инфракрасного диапазона или оптической компьютерной мыши. Во время длительных тренировок, которые длятся более одного или двух часов, подумайте о том, чтобы обеспечить мышь питьевой водой вручную или с помощью держателя пипетки, прикрепленного к каркасу клетки мобильного дома.

На следующей схеме обобщена временная шкала типичного экспериментального исследования. Исследование начинается с имплантации черепного окна за две недели до работы с мышью и продолжается восемью тренировочными сессиями два раза в день. Типичное исследование включает в себя ряд сеансов визуализации или записи патч-клэмпа, которые проводятся с интервалом от нескольких часов до нескольких дней или недель.

Как оптические, так и электрофизиологические эксперименты могут проводиться параллельно с когнитивными или поведенческими стимулами и показаниями. Двухфотонная микроскопия – это уникальная нелинейная оптическая технология, которая позволяет в режиме реального времени визуализировать клеточные и даже субклеточные структуры в глубоких корковых слоях мозга грызунов. Чтобы провести эксперимент с двухфотонной микроскопической визуализацией, поместите обученное животное в клетку мобильного дома, отрегулируйте стопоры для защиты оптики микроскопа от случайного повреждения.

Очистите покровное стекло черепного окна для удаления частиц пыли. Капните иммерсионную жидкость на покровное стекло. Мы рекомендуем использовать вискусовый раствор, потому что вода быстро испаряется.

Платформа может быть размещена на вершине типичного моторизованного оптического стола с использованием широкоугольного режима флуоресцентного микроскопа и длинночастотного эмиссионного фильтра. Оцените сосудистую сеть головного мозга и выберите интересующую область. Для визуализации корковой сосудистой сети введите в хвостовую вену головы неподвижного и обездвиженного животного, 70 кг Далтон, Техас красный сопряженный текст Тран.

Эта последовательность изображений показывает покадровую запись мест и артерий в коре головного мозга мыши во время ее перемещения по клетке мобильного дома. Построив профиль линий, проведенных поперек просвета сосуда, можно измерить изменения диаметра сосуда и подвижность отдельных сегментов сосуда. Скорость кровотока в артериях и венах можно измерить путем сканирования линий вдоль линий, проведенных параллельно стенке сосуда. Штраф.

Детали морфологии нейронов могут быть визуализированы у трансгенных мышей, экспрессирующих YFP в субпопуляции нейронов под тайваньским промотором. Эти два снимка Зака сравнивают стабильность визуализации у животных, находящихся под наркозом, и у бодрствующих животных. На правой боковой панели показаны дендриты животного, обезболившего смесью кетаминаксилазина.

В то время как на левой боковой панели отображается изображение дендритов в бодрствующем животном, гуляющем вокруг клетки передвижного дома. Индивидуальная морфология позвоночника у бодрствующих животных может быть проанализирована с той же надежностью и точностью, что и у мышей под наркозом. Смещение мозга во время бега животных обычно не превышает одного-полутора микрометров.

Эти движения происходят в горизонтальном направлении и очень редко приводят к смещению плоскости изображения, что делает коррекцию артефактов движения ненужной. В большинстве случаев способность хронически контролировать активность нейронов в бодрствующем живом мозге имеет важное значение для понимания организации и функционирования нервной системы. Используя трансгенных мышей с помощью трех трансгенных мышей, мы визуализировали спонтанную нейронную активность у бодрствующих мышей, ведущих себя в клетке мобильного дома.

Эта последовательность изображений показывает репрезентативные примеры всплесков кальция в телах нейронных клеток, нитах и аксонах. Оптическая визуализация, основанная на собственных сигналах, позволяет составить карту пространственного распределения функциональных доменов для проведения эксперимента по собственной оптической визуализации. Поместите обученное животное в домашнюю клетку, расположенную под объективом камеры.

Очистите покровное стекло от пыли. Нанесите каплю глицерина и накройте ее пятимиллиметровой круглой крышкой-листом. Настройте положение высокоскоростной камеры.

Расположите манипулятор с трубкой для обдува воздухом напротив контралатеральной вибры. Используйте зеленый свет для отображения карты судна. Сосредоточьтесь глубже в коре головного мозга, примерно на 400 микрометров ниже корковых сосудов.

Поместите полосовой фильтр перед камерой и подсветите кору головного мозга красным светом. Дайте мыши приспособиться к платформе не менее 30 минут. Запишите базовую активность в течение шестиминутного эпизода.

Стимулируйте вибрацию каждые 10 секунд с помощью воздушных затяжек в течение шести минут. Это изображение иллюстрирует нейронную активность, распространяющуюся вдоль соматосенсорной коры в ответ на вибрационную стимуляцию с частотой 0,05 герц. Для проведения электрофизиологической записи одиночных клеток поместите обученное животное, которому имплантировано перевернутое черепное окно, в клетку мобильного дома.

Медленно и осторожно снимите покровное стекло с металлического держателя. Освежите кортикальный буфер и очистите окно черепа от мусора с помощью гемостатического тампона. Поместите заземляющий электрод в кортикальный буфер.

Наполните клеточную пипетку пластырем внутриклеточным раствором. Подайте положительное давление на записывающую пипетку с помощью моторизованного микроманипулятора, углубите пипетку в кору головного мозга и получите гига-герметичный контакт с интересующей клеткой. После записи извлеките пипетку, обновите кортикальный буфер и закройте черепное окно, приклеив покровное стекло к металлическому держателю.

Использование пневматической домашней клетки позволяет сочетать визуализацию и электрофизиологию с классическими поведенческими парадигмами, такими как обучение, реабилитация или поведение, связанное с тревогой. Обоняние является важным сенсорным входом для мышей и может быть использовано для стимуляции в тестах на память, а также для оценки реакции на новизну. Чтобы провести тест на привыкание к обонянию, поместите обученное животное в клетку для передвижного дома и дайте ему привыкнуть.

На 30 минут приложите чистый кусок ваты, смоченный в водопроводной воде, к внутренней стенке клетки мобильного дома с помощью двустороннего скотча. Через пять минут замените чистую вату на стене домашней клетки на новую, смоченную в жидкости, содержащей запах ванили. Повторите пятиминутное воздействие ванильного запаха три раза с пятиминутными интервалами между сеансами.

Для измерения уровня интереса следует обратить внимание на запах. Подсчитайте суммарное время, которое животное проводит лицом к целевой зоне, и общее время перемещения клетки в передвижном доме. Во время последнего, пятого сеанса, подарите социально значимый запах.

Намочите новый ватный аппликатор несколькими каплями мочи мышей противоположного пола. Чтобы оценить реакцию на новинку, разделите клетку мобильного дома на четыре зоны. Прикрепите два хлопчатобумажных куска друг к другу. Цвет.

Закодируйте их маркерами на внешней стороне стен домашней клетки во время первого испытания. Положите два чистых кусочка ваты. Затем замените их оба ватой, смоченной в 1% экстракте ванилина.

Во время третьего испытания поместите ванильный хлопок в зону номер один, а кусок ваты, смоченный в 1% экстракте банана, — в зону. Во-вторых, измерить предпочтение отсутствию запаха. Рассчитайте время, которое животные проводят лицом к лицу без запаха, в процентах от совокупного времени, проведенного лицом к другим зонам.

Здравствуйте, меня зовут Лео Киро, я главный исследователь в Центре нейронаук Хельсинкского университета. Надеюсь, вы получили удовольствие от просмотра видео и нашли его полезным. В течение последних пяти лет мы работаем с компанией twofold над микроскопией in vivo, и использование общей и эстетической медицины всегда было большой проблемой, потому что эстетика вмешивается в работу мозга, в кровоток и все остальное.

И сегодня я счастлив, что мы можем работать на бодрствующих животных и проводить стабильные эксперименты по микроскопической визуализации, а также подтверждать и верифицировать результаты, которые мы ранее получили на животных, находящихся под наркозом. Я уверен, что использование клетки для передвижных домов и те методы, которые мы сегодня представили, повысят актуальность исследований in vivo в целом и приведут к новым и прорывным результатам, и я с нетерпением жду этого.