Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за морфологией и динамикой клеточных органелл на массиве микрополостей, имитирующих трехмерную среду, встречающуюся в физиологических условиях. Для клеток с жесткими стенками, таких как дрожжи деления, полости могут организовывать и ориентировать клеточные структуры. Это достигается путем предварительного изготовления массива столбов PDMS от мастера для получения массива микрополостей PDMS, называемых чашками для яиц, путем литья реплик.

В качестве второго шага яйцевые чашки функционализируются белками внеклеточного матрикса и вводятся в трубку с цилиндрической пластиковой деталью, изготовленной на заказ, которая поддерживает образец микрополости и позволяет вводить отдельные клетки млекопитающих в каждую из микрополостей. Затем яйцевые стаканчики, заполненные клетками, извлекают и инкубируют с интересующим препаратом или соединением с целью изучения фенотипа и динамических процессов клеток в 3D-условиях. Получены результаты, которые показывают различия в клеточном фенотипе и новых динамических структурах, наблюдаемых по сравнению со стандартными 2D-анализами in vitro, основанными на ориентации клеток.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как стандартные двухмерные анализы клеточных культур, заключается в том, что клетки млекопитающих в яичных чашках воспринимают 3D-среду, аналогичную логической микросреде, но расположены в упорядоченном и стандартизированном порядке. Порядок и ориентация также являются значительными улучшениями в случае деления дрожжей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного скелета и разработки лекарств, таких как выявление новых и противораковых препаратов с высоким содержанием скрининга.

Применение этого метода распространяется на диагностику многофакторных заболеваний, таких как рак, поскольку скрининговые анализы лекарств могут быть легко выполнены и проанализированы с помощью яичных чашек, что делает этот метод особенно интересным для персонализированной медицины. Этот метод может дать внутренний ключ к пониманию организованных структур и динамики в отдельных клетках млекопитающих и клетках делящихся дрожжей, а также может быть применен для организации исследований, развития эмбрионов, таких как C.elegans и ri-so-flu-a. В этом протоколе массив микрополостей или чашек для яиц наносится на слой полидиметилсилоксана или PDMS, прикрепленный к покровному стеклу методом литья реплики.

Первым делом происходит изготовление мастера, который не будет показан, но описан в текстовом протоколе. После того, как мастер изготовлен, следующим шагом является изготовление реплики PDMS. В пробирке объемом 50 миллилитров тщательно смешайте сшивающий агент и преполимер в соотношении вес к весу к весу один к 10 или объему к объему, что в общей сложности составит 30 граммов.

Центрифугируйте пробирку при 1,800 г в течение пяти минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Аккуратно опустите PDMS на главный модуль. Если появились пузырьки, дегазируйте смесь.

Поместите образец в духовку при температуре 65 градусов Цельсия на четыре часа. После того, как PDMS будет отвержена, с помощью скальпеля аккуратно разрежьте интересующую область площадью около одного квадратного сантиметра, которая включает в себя примерно от 10 до пятой микрополостей или стаканчиков для яиц. Аккуратно снимите штамп PDMS.

Чтобы начать процедуру формования реплики, активируйте штамп PDMS с помощью кислородной плазменной обработки в течение 30 секунд. Временно храните активированный штамп в закрытой чашке Петри, чтобы предотвратить отложение пыли. Работая в вытяжном шкафу, поместите активированный штамп PDMS стороной со структурами вверх или вверх в чашку Петри рядом с колпачком объемом 15 миллилитров.

Наполните крышку 200 микролитрами триметилхлорсилана. Закройте чашку Петри и дайте штампу посолиться в течение семи минут. Поместите штамп PDMS на прядильный станок структурами вверх ногами.

Сверху на конструкции нанесите небольшую каплю жидкости PDMS. Отжимайте слой со скоростью 1500 об/мин в течение 30 секунд, чтобы нанести тонкий слой PDMS поверх конструкций. Поместите штамп в духовку при температуре 65 градусов Цельсия на четыре часа, чтобы отверждение отосажденного слоя PDMS с отверждением.

Затем активируйте тонкий слой PDMS, поместив штамп PDMS вверх ногами вместе со стеклянной крышкой в кислородную плазменную очистительную установку на 30 секунд. Немедленно поместите штамп в контакт со стеклянной крышкой и аккуратно прижмите пинцетом по всей поверхности штампа для склеивания. После этого держите постоянное давление на верхнюю часть штампа в течение примерно 10 секунд.

Через 30 минут аккуратно снимите штамп с крышки, чтобы освободить стаканчики для яиц. Будьте очень осторожны, чтобы не сломать пробу. Тщательно промойте стаканчики для яиц этанолом и высушите.

Если чашки для яиц PDMS не находятся на стеклянной крышке и отсоединяются во время этапа открепления, рассмотрите возможность регулировки настроек плазменного очистителя и повторите процедуру формования реплики. Чтобы облегчить работу с образцом в дальнейшем, рекомендуется приклеить небольшой кусочек отвержденного PDMS по краю покровного стекла. В случае клеток млекопитающих, представленных в этом видео, поверхность PDMS должна быть функционализирована белками адгезии внеклеточного матрикса.

Гидрофилизируйте чашки для яиц в кислородном плазмочистителе в течение 30 секунд. После этого простерилизуйте стаканчики для яиц ультрафиолетом в течение пяти минут. Нанесите небольшую каплю раствора фибронектина, чтобы покрыть всю площадь яйцевой чашки, и выдерживайте в течение одного часа при комнатной температуре.

Беречь образец от высыхания. Аккуратно промойте чашки для яиц примерно одним миллилитром PBS с помощью пластиковой дозирующей пипетки. Повторите в общей сложности три раза.

Далее поместите изготовленный на заказ цилиндрический пластиковый кусочек в трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте в пробирку 13 миллилитров среды для клеточных культур. Среда должна возвышаться над цилиндрической деталью не менее чем на два сантиметра, чтобы обеспечить полное погружение образца.

Используя острый и прямой пинцет, чтобы удерживать образец за ручку PDMS, осторожно поместите стаканчики для яиц внутрь пробирки, осторожно нажимая на крышку, пока она не ляжет на верхнюю сторону пластикового куска и не будет полностью погружена. Клетки, которые должны быть введены в чашки для яиц, должны быть культивированы до 80-100% конфлюенции и ресуспендированы в пяти миллилитрах питательной среды. Пипеткой нанесите 200 микролитров клеток на верхнюю часть яйцевых чашек, опуская клетки как можно ближе к верхней части яйцевых чашек, но избегая физического контакта.

Это предотвратит поломку и/или повреждение образца. Центрифугируйте 50-миллилитровую пробирку при 1,800 м g в течение двух минут. Пипеткой нанесите еще 200 микролитров клеток на чашки для яиц и снова центрифугируйте при 1800 г в течение двух минут.

Повторите в общей сложности три раза, чтобы оптимизировать процент заполнения. После последнего центрифугирования проверьте процент наполнения яичных чашек с помощью микроскопа. Используя пинцет, чтобы удерживать ручку PDMS, осторожно извлеките образец из пробирки, не потревожив клетки в чашках для яиц, и поместите образец в чашку Петри со средой.

Чтобы удалить лишние клетки, которых нет в чашках для яиц, промойте их путем аккуратного пипетирования вверх и вниз три раза рядом с каждой стороной массива микроструктуры. Наконец, замените среду свежей средой, чтобы удалить неприкрепленные клетки. Чтобы наблюдать за неподвижными клеточными органеллами, поместите чашки с неподвижным образцом на предметное столико эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа и выберите объектив с 60-кратным увеличением масла.

В этом примере образец представляет собой фибробласты NIH 3T3, в которых были окрашены аппарат Гольджи, ядро и волокна актина. Тщательно фокусируйтесь с помощью яркого полевого света до тех пор, пока яйцеклетки не окажутся в плоскости наблюдения. Выберите и сфокусируйтесь на интересующей вас области и начните съемку изображения.

Начните эту процедуру с помещения стаканчиков для яиц в держатель для микроскопа и наполните его одним миллилитром 10%-ной среды для культивирования клеток FCS L15. Установите держатель на предметный столик микроскопа. Чтобы избежать испарения, сверху держателя накройте стеклянную крышку.

Наблюдайте за клетками с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа, оснащенного 60-кратным масляным объективом. В этом примере используются клетки HeLa, которые экспрессируют флуоресцентно помеченные миозин и актин, две ключевые молекулы, участвующие в смыкании цитокинетического кольца во время митоза. Выберите интересующую область и найдите цитокинетическое кольцо, используя либо GFP, либо канал Texas Red.

Точная фокусировка. Запустите автоматический сбор данных по обоим каналам до полного замыкания кольца. Изображения чашек для яиц, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, показывают, что их форма и размер очень правильные.

Для клеток с жесткими стенками, таких как дрожжи деления, яйцевые чашки могут ориентировать цитокинетическое кольцо. Для клеток млекопитающих сравнение между клетками на 3D-чашках для яиц и двумерными плоскими поверхностями показывает, что первые образуют упорядоченный массив с однородным сферическим фенотипом, в то время как вторые демонстрируют неупорядоченную и неоднородную морфологию. Клетки на яичных чашках также демонстрируют уменьшение количества стрессовых волокон, о чем свидетельствует количество умеренных эффектов от лечения Блеббистатином.

Аппарат Гольджи на 2D-культурах обычно показывает расширенный фенотип, тогда как в яичных чашках он показывает более компактный фенотип. Это было подтверждено количественной оценкой фенотипов Гольджи. Наконец, на двухмерных поверхностях ядро клетки ориентировано случайным образом, тогда как на яйцевых чашках оно ортогонально в плоскости xy, как в клетках дикого типа, так и в клетках, обработанных Блеббистатином.

Определение значений сферичности ядра показывает, что яйцевые чашечки не влияют на нормальную сферичность ядра клетки. Тем не менее, разница между клетками дикого типа и клетками, обработанными Блеббистатином, на яичных чашках позволяет предположить, что яйцевые чашки демонстрируют реальный эффект препарата, который замаскирован под 2D. Исследования живых клеток с использованием стаканчиков для яиц позволяют идентифицировать новые активные процессы, которые не видны в стандартных культурах.

Например, в клетках HeLa наблюдалось периодическое накопление миозина, которое движется радиально по мере того, как цитокинетическое кольцо смыкается во время митоза. После освоения чашки для яиц можно приготовить из копии менее чем за шесть часов, а наполнение ячеек можно сделать примерно за 15 минут. Пытаясь выполнить этот процесс, важно иметь размер яйцевых чашек по отношению к исследуемым клеткам.

Эта процедура может быть в дальнейшем адаптирована к высокосодержательным скрининговым платформам в фармацевтических компаниях для массовых скрининговых мероприятий, а также для персонализированных диагностических анализов пациентов при оценке индивидуальных специфических методов лечения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать и использовать микрополости для яичных чашек. Яйцевые чашки стандартизируют и упорядочивают множество подобных систем, начиная от отдельных клеток без стенок, таких как клетки млекопитающих, и заканчивая системами со стенками, такими как дрожжи и эмбрионы.