Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать субклеточное фракционирование мозговой ткани с использованием прерывистого градиента сахарозы для обогащения белками из синаптических мембран и постсинаптической плотности. Это достигается путем гомогенизации мозговой ткани с помощью мощного гомогенизатора. Далее следует серия этапов центрифугирования для получения экстрактов сырого мембранного белка.

Затем мембранные экстракты наслаиваются на прерывистый градиент сахарозы для ультрацентрифугирования. Заключительным этапом является сбор белков из градиента. В конечном счете, результаты могут показать изменения в уровнях синаптических белков с помощью вестерн-блоттинга.

Это хорошо зарекомендовавшая себя методика, которая используется нейробиологами уже более 40 лет. Мы используем его в нашей лаборатории, чтобы понять, как меняется белковый состав синапса, когда мы возмущаем различные нейротрансмиттеровые системы. Основное преимущество этого метода перед другими методами, такими как градиенты по вызову или непрерывные градиенты сахарозы, заключается в том, что прерывистые градиенты сахарозы легче построить вручную.

Этот протокол использует стеклянный тефлоновый гомогенизатор с приводом от двигателя, всегда заменяйте пестик между образцами, промывайте и сушите. Гомогенизатор сначала загрузит рассеченную ткань в 13-миллилитровую трубку с четырьмя миллилитрами 0,32 молярного буферного раствора сахарозы HEPA. Затем переложите ткань в чистый стеклянный гомогенизатор.

Установите двигатель на 900 об/мин и гомогенизируйте образец за 12 движений в течение 30 секунд, используя менее четырех граммов ткани, обеспечьте хорошее фракционирование, перенесите образец обратно в пробирку и храните 100 микролитров аликвоты при минус 80 градусах Цельсия для анализа белка. Затем отделите ядерный материал, вращая гомогенат при 900 G в течение 10 минут. При четырех градусах Цельсия перенесите надосадочную жидкость в новую 15-миллилитровую трубку.

Надосадочная жидкость содержит сырую мембранную фракцию. Теперь, чтобы обогатить необработанную синаптосомную центрифугу, надосадочную жидкость при 10 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, удалите надосадочную жидкость. Гранула содержит сырую синаптосомную фракцию Resus.

Суспензируйте его в одном миллилитре 0,32 молярного раствора сахарозы. Затем еще при трех миллилитрах раствора в суспензию центрифугировать сырую фракцию в течение 15 мин. При 10 000 G при четырех градусах Цельсия удалить надосадочную жидкость. Теперь быстро влайфуйте гранулу, повторно суспендируйте гранулу в миллилитре чистой воды.

Затем быстро добавьте еще три миллилитра воды. Перенесите это в гомогенизатор. Нанесите три удара рукой и перенесите обратно в тюбик объемом 13 миллилитров.

Быстро отрегулируйте образец обратно до четырех миллимолярных ГЭА с добавлением 16 микролитров одномолярных ГЭА и перемешайте его путем инверсии. Теперь поместите образец на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на полчаса. Чтобы обеспечить лизис образца, завершите фракционирование гранулированием лизированной P двух простых фракций.

Убавьте его при 25 000 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в миллилитре раствора сахарозы. Он содержит обогащенные эписомальные мембраны синапа. Во-первых, предварительно измерьте буферы, чтобы получить прерывистый градиент сахарозы.

Загрузите три пробирки следующим образом, в одну ровно 3,5 миллилитра 1,2 молярных кучи буферизованного раствора сахарозы. Другой с ровно тремя миллилитрами 1,0 молярного раствора, а третий с тремя миллилитрами 0,8 молярного раствора. Далее с помощью стеклянной пипетки для вредителя переведите 1,2 молярного раствора сахарозы в полимерную ультрацентрифужную пробирку объемом 12 миллилитров.

С помощью новой пипетки осторожно нанесите молярный раствор 1,0 на молярный раствор 1,2. Не тревожьте молярный раствор 1,2 и не вводите пузырьки с пипеткой. Используйте ту же технику, чтобы наложить сверху раствор 0,8 моляра.

Будьте осторожны. Небольших вибраций от настольного вихря или микроцентрифуги достаточно, чтобы нарушить целостность градиента. Важно аккуратно и эффективно выстраивать градиенты.

Если это займет слишком много времени или если градиент подвергнется воздействию вибрации, вы не сможете восстановить синаптические мембраны на последующих этапах. Теперь с помощью еще одной пипетки нанесите слой обогащенной синапа фракции эписомальной мембраны поверх подготовленного градиента. Точно сбалансируйте градиент в ультрацентрифуге с качающимся ротором ковша.

Затем убавьте его до 150 000 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Будьте очень внимательны при удалении градиента из ведра после центрифугирования, там должны остаться прозрачные полоски раствора сахарозы. При наличии белковых фракций на каждой границе раздела и гранул фракции не должны быть диффузными.

С помощью иглы 18 калибра и шприца объемом 1 миллилитр проколите нижнюю часть молярного интерфейса до 1,2 и удалите белую полосу белка, которая содержит синаптические плазматические мембраны. Запишите объем этого слоя. Переложите слой в ультрацентрифужную пробирку со стенками толщиной 3,5 миллилитров.

Добавьте ровно 2,5 объема четырех миллимолярных ГЭА. Затем приготовьте балансирную пробирку с 0,32 молярными ГЭА буферизованным раствором сахарозы в роторе с фиксированным углом, ультрацентрифугируйте образец при 200 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем выбросьте сенну и повторно суспендируйте синаптическую плазматическую мембранную гранулу.

В 300 микролитрах 50 миллимолярных ГЭА два миллимоляра раствора ЭДТА. Постсинаптическая фракция плотности или фракция PSD теперь может быть собрана путем дальнейшего использования тех же методов. Шаги четко прописаны в текстовом протоколе.

Вестерн-блоттинг проводили с использованием общего белка, синаптической плазматической мембраны и первых фракций белка постсинаптической плотности. Фракция ПСД подверглась только одной обработке детергентом, и ткань была получена из стриатума мыши. Пресинаптические белки, такие как транспортер дофамина, обогащаются фракцией SPM, но удаляются на последующей стадии детергента для обогащения PSD.

Выполняя эту процедуру, важно помнить о том, что все образцы должны быть на льду и включать в них ингибиторы протеазы и фосфатазы. Могут быть выполнены и другие методы, такие как западный анализ крови или двухмерный гель-электрофорез. Затем вы можете ответить на такие вопросы, как влияние медикаментозного лечения на уровень рецепторов в синапсе.