В режиме реального времени изображений аксонов транспорта квантовой точке меченных BDNF в первичных нейронах

Общая цель этой процедуры заключается в отслеживании ретроградного аксонального транспорта нейротрофического фактора мозга или BDNF с помощью визуализации в реальном времени. Это достигается путем предварительной сборки микрофлюидных камер на покровных стеклах с полилизиновым покрытием. На втором этапе диссоциированные нейроны гиппокампа крысы E 18 рассекаются и помещаются в компартмент тела клетки микрофлюидной камеры.

Затем нейроны культивируют, чтобы обеспечить расширение аксонов через микробороздки в аксональный отсек камеры. На последнем этапе в отсек аксонов добавляется квантовая точка, помеченная BDNF. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия может быть использована для оценки движения BDNF в аксонах нейрона гиппокампа.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как B-D-F-E-G-I-P или BDFM мечение вишни, заключается в том, что мечение BDF квантовыми точками позволяет получить световое изображение одного димера BDF внутри аксонов, демонстрируя, что процедура будет, будет. Нарисуйте точку слева от моих трех, начните с ручной промывки микрофлюидных камер в 1% aox, а затем три 30-минутных полоскания в воде milli Q. Затем после ручной промывки камер в 70% этаноле разложите их сушиться на параме в ламинарном проточном колпаке, простерилизуйте обе стороны камер под ультрафиолетовым светом в течение 20 минут, а затем храните облученные камеры в стерильной 15-сантиметровой посуде, запечатанной парамом при комнатной температуре.

Далее замачиваем 24 на 40 миллиметров. Стеклянная крышка номер один опускается в 10% соляной кислоты на ротатор на ночь, а затем следует три 30-минутных промывки водой после последней промывки. Стерилизуйте каждую крышку, погрузив в 100% этанол, с последующим обжигом над конфоркой Бунзена и храните их в сухом виде в стерильной чашке Петри при комнатной температуре.

Чтобы покрыть покровные листы, положите их в 15-сантиметровую чашку для культивирования, а затем посыпьте каждый 0,7 миллилитра 0,01% поли-л лизина. После часовой инкубации в вытяжке для тканевых культур снова трижды промойте крышки стерильной водой, а затем высушите их вакуумом и поместите в шестисантиметровую чашку для культивирования. Затем поместите одну из стерилизованных камер стороной с микроканавками вниз на защитное стекло с покрытием из полихлорида L лизина.

Старайтесь не касаться микроканавок и используйте наконечник микропипетки, чтобы аккуратно надавить на камеру и плотно закрыть собранную микрофлюидную камеру. Теперь поместите двух крыс E 17 - E 18 Hippo Campi в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую два миллилитра буфера для вскрытия, и прополощите ткани три раза пятью миллилитрами буфера для рассечения каждый раз. Затем удалите как можно больше смывателя и добавьте 900 микролитров свежего буфера для рассечения, чтобы переварить ткань.

Далее добавьте в салфетки 100 микролитров 2,5% трипсина и поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. После 10 минут разложения добавьте 100 микролитров ДНК и используйте отполированную до огня пипетку из полиэтиленового стекла, чтобы осторожно оценить ткани вверх и вниз от пяти до 10 раз сразу после смешивания. Закалите триин двумя миллилитрами гальванической среды и дайте мусору осесть на дно пробирки в течение пяти минут в колпаке для культуры тканей.

Далее осторожно перелейте два миллилитра надосадочной жидкости в чистую стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров и раскрутите клетки вниз. Суспензируйте гранулу в 50 микролитрах гальванической среды, а затем, подсчитав, загрузите от 15 до 20 микролитров клеточной суспензии в один отсек микрофлюидной камеры. Инкубируйте камеру в течение 10 минут, чтобы ячейки могли прикрепиться к крышечному стеклу, а затем добавьте больше гальванического материала, чтобы заполнить оба отсека камеры.

После одного дня инкубации замените гальваническую среду на поддерживающую среду как в теле клетки, так и в отсеках аксонов. На третий день аксоны нейронов гиппокампа начинают пересекать микробороздки, достигая аксонного отсека между пятым и седьмым днями. В течение этого времени заменяйте половину питательной среды свежей средой для технического обслуживания каждые 24–48 часов перед визуализацией BDNF Axonal Transport в реальном времени.

Тщательно промывайте оба компартмента микрофлюидной камеры бессывороточными нейробазальными средами без сыворотки BDNF каждые 30 минут в течение двух часов во время истощения BDNF, инкубируйте 50 наномолярный монобиотинилированный димер BDNF с 50 наномолярным квантовым. Сделайте 6, 5, 5 стриппинговых конъюгатов в нейробазальной среде на льду в течение 60 минут. Затем замените среду в отсеке аксонов 300 микролитрами квантовых точек, меченных BDNF, в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы свести к минимуму диффузию квантовых точек, меченных BDNF, в отсек тела клетки.

Очень важно всегда поддерживать более высокий уровень среды в отсеке тела клетки, чем в отсеке аксонов в конце инкубации, прогрева и инвертированного микроскопа, оснащенного 100-кратным масляным объективом и климатической камерой, до постоянной температуры 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа во время прогрева оборудования. Смойте несвязанную квантовую точку, помеченную BDNF, из микрофлюидной камеры, а затем используйте набор техасских красных кубов возбуждения и излучения для визуализации сигнала квантовой точки 6 5 5. Наконец, используйте ПЗС-камеру для захвата покадровых изображений в средних аксонах со скоростью один кадр в секунду в общей сложности в течение двух минут.

Используйте микроканавки без аксонов, которые не имеют квантовой точки, в качестве контроля для инфильтрации и анализируйте транспорт BDNF с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений в покадровой съемке квантовых точек, помеченных сигналом BDNF. Сигналы квантовых точек наблюдаются в большинстве микроканавок с аксонами, в то время как в микроканавках без аксонов квантовый сигнал не виден, что указывает на незначительную или отсутствующую диффузию сигнала квантовой точки из отсека аксонов в отсек тела клетки здесь. Сегмент аксона нейронов гиппокампа длиной 80 микрометров был флуоресцентно записан в течение 100 секунд. Всего шесть.

Во время визуализации были четко отмечены квантовые сигналы BDNF, три из которых двигались в одном направлении к телу клетки. Было замечено, что один сигнал плавно движется к телу клетки, пересекая все поле примерно за 70 секунд. Другой человек двигался в ретроградном направлении в течение первых 20 секунд, переходил в антроградное движение на 10-20 секунд, а затем снова менял направление в сторону тела клетки в течение последних 20 секунд.

Также было отмечено, что третье событие движется в ретроградном направлении, но затем останавливается примерно на 20 секунд в середине движения. На этом первом репрезентативном графике квантовых точек, меченных транспортом BDNF, квантовая точка, помеченная BDNF, быстро и плавно двигалась к телу клетки, пересекая 80-микрометровое поле примерно за 60 секунд. С очень короткими паузами во втором хронографе квантовый BDNF проехал примерно 50 микрометров за 120 секунд в ретроградном направлении, по крайней мере, с тремя сегментами более длинных пауз.

Наконец, точечные диаграммы измеряют скорость движения, среднюю скорость и время паузы каждой отдельной квантовой точки, помеченной BDNF. Скорость движения квантовой точки, обозначенной BDNF, была относительно высокой, в диапазоне от 0,47 до 1,97 микрометра в секунду со средним значением 1,06 плюс-минус 0,05 микрометра в секунду. Из-за паузы BDNF во время транспортировки средняя скорость была значительно ниже скорости движения со средней скоростью 0,48 плюс-минус 0,03 микрометра в секунду со средней продолжительностью пауз 15,88 плюс-минус 1,30 секунды после проявки.

Этот метод позволяет исследователям в области нейробиологии изучать нейротрофин и трафик рецепторов в здоровых и больных нейронах.