В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать взаимодействие белковых рецепторов с использованием поверхностной плазмы и резонанса. Это достигается путем впрыска ионов никеля через нитротриуксусную кислоту или матрицу NT a. Затем один из белков, называемый лигандом, иммобилизуется на сенсорный чип после инъекции холостого патрона.

Второй белок, называемый аналитом, вводится через иммобилизованный лиганд. Для того, чтобы обнаружить взаимодействие между двумя белками, результаты показывают, что два белка временно взаимодействуют, аналит ассоциируется и диссоциирует от лиганда. Аффинность взаимодействия может быть рассчитана на основе измеренных скоростей диссоциации и диссоциации двух белков.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как снижение или иммунопреципитация, заключается в том, что он может идентифицировать переходные или низкоаффинные взаимодействия, которые часто имеют большие биологические последствия. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биохимии, такие как связывается ли интересующий белок с другим белком или другой малой молекулой, можно определить природу взаимодействия и измерить аффинность. Чтобы подготовить образец, удалите все агрегаты из очищенного белка, как описано в текстовом протоколе.

Подготовьте рабочий буфер и отфильтруйте все буферы и образцы белка с помощью фильтров с нулевой точкой 22 микрона. Заранее убедитесь, что фильтры совместимы с белком, прежде чем подключать работающую буферную бутылку к входному отверстию насоса. Отложите в сторону 10 миллилитров работающего буфера в отдельной пробирке.

Затем разбавьте сэмплы относительно работающего буфера, чтобы избежать несоответствий буфера. Как правило, для стабильной демобилизации лиганда используйте низкие концентрации лиганда при более длительных инъекциях при низком потоке, в отличие от высоких концентраций лиганда. При более коротких инъекциях при высоком потоке разбавьте концентрированный запас лиганда в буфере до конечной концентрации примерно 20 мкг на миллилитр. Наконец, разведите аналит в рабочем буфере до желаемой концентрации.

Для системы с неизвестным сродством испытайте диапазон концентраций аналита от 10 микромоляров до 10 аномоляров в десятикратных разведениях. В данной демонстрации повторно используется чип, связанный с NTA, подходящий для захвата белков с помощью метки оли гистидина. После извлечения хранящейся чипсы из буфера тщательно промойте ее водой двойной дистилляции, аккуратно высушите и поместите в ее первоначальную оболочку.

Чтобы пристыковать чип к прибору SPR, откройте дверцу чипа датчика и поместите чип в его оболочку. Закройте дверцу и нажмите на док-чип. Установите температуру ячейки чипа на 25 градусов Цельсия.

Установите отсек для образцов на семь градусов Цельсия, чтобы сохранить стабильность белка на протяжении всего эксперимента. После подготовки растворов к загрузке и зачистке, как описано в текстовом протоколе, заправьте прибор SPR рабочим буфером. Для следующего шага установите расход на 50 микролитров в минуту.

Определите пути потока и эталонное вычитание, чтобы получить описанные здесь результаты. Задайте пути к проточной ячейке номер один и проточной ячейке номер два и проточной ячейке номер один, вычтенной из проточной ячейки номер два, после выбора подходящей штатива для образцов сохраните файл результатов перед началом эксперимента, чтобы данные были сохранены во время прогона. Каждый эксперимент состоит из циклов.

Ведите четкий учет инъекций, выполненных в каждом цикле, и разделяйте лиганды, загружающие заготовительную инжекцию буфера и инжекцию аналита, на разные циклы. Первый цикл – подготовка стружки и загрузка никеля. Убедитесь, что поток и пути установлены и затем введите 350 миллимолярный ЭДТА в течение одной минуты, чтобы смыть оставшиеся молекулы.

Далее установите расход на 10 микролитров в минуту. Затем вводят 0,5 миллимоляра хлорида никеля в течение двух минут. Теперь смола чипа покрыта ионами никеля.

Второй цикл – иммобилизация лиганда. Установите расход на 15 микролитров в минуту и задайте путь потока к ячейке потока. Во-вторых, вводите лиганд А до тех пор, пока не будет достигнуто значение единицы отклика или R ru, которое в 10-20 раз больше молекулярной массы лиганда.

Например, загрузить лиганд в 50 килодальтон в диапазон 501 000 руб. Ведите учет достигнутого значения ЕЗ. Затем установите расход на 15 микролитров в минуту и путь потока к проточной ячейке номер один, введите контрольный лиганд B до того же значения RU, что и у лиганда, а затем контролируйте вычитание, сенсоры Грэхема в режиме онлайн, чтобы помочь контролировать длину инъекции.

Далее установите расход на 50 микролитров в минуту и путь потока к проточной ячейке номер один и проточной ячейке. Во-вторых, продолжайте мыть систему в течение пяти-20 минут, пока базовая линия не стабилизируется. Третий цикл — это инъекция холостого метода.

Этот впрыск послужит для вычитания холостого листа. Поэтому включите в него все компоненты, которые будут вводиться вместе с аналитом, за исключением самого аналита. Длина впрыска может варьироваться в зависимости от времени, необходимого для достижения равновесия.

Установите расход на 15 микролитров в минуту и установите путь потока на проточную ячейку номер один и проточную ячейку номер два, а также проточную ячейку номер один, вычтенную из проточной ячейки. Во-вторых, вставьте команду веса на 30 секунд, чтобы достичь стабильной базовой линии. Затем введите рабочий буфер на 13 секунд.

Подождите от 120 до 600 секунд, чтобы записать фазу диссоциации. Длина этого шага варьируется в зависимости от kd. Чем медленнее диссоциация, тем дольше должен быть этот шаг.

Четвертый цикл – введение аналита. Скопируйте и вставьте точные условия, использованные в третьем цикле, чтобы впоследствии можно было вычесть эти две инъекции. Измените положение слота в штативе с гнезда, в котором находится раствор для управления, на гнездо, в котором находится раствор аналита.

Выберите концентрацию, которая немного превышает ожидаемую константу диссоциации равновесия. Если предварительных знаний нет, выберите один микромоляр в качестве хорошей отправной точки. После выполнения впрыска буфера и впрыска аналита во второй раз, выполните седьмой цикл отключения микросхем.

Установите расход на 50 микролитров в минуту, затем введите 350 миллимоляров ЭДТА в течение одной минуты. Повторите этот шаг еще два раза. Не используйте однократный впрыск в течение трех минут, так как это может повредить чип.

Затем введите 0,25% сульфата натрия в течение одной минуты. Повторите этот шаг два раза. Не используйте однократный впрыск в течение трех минут, так как это может привести к повреждению чипа после загрузки никелем, интересующий транспортер иммобилизуется на проточную ячейку номер два до 3 500 R rus.

Затем, используя тот же поток и продолжительность инъекции, контрольный лиганд вводят в проточную ячейку номер один, первоначально достигая только до 3000 R, чтобы убедиться, что одинаковое количество белка иммобилизовано на обеих проточных ячейках. Регулирующий лиганд дополнительно нагружается с более коротким впрыском при контроле нагрузки до 3 500 RDU. Форма лестницы представляет собой постепенное увеличение массы проточной ячейки номер один при каждой инъекции, показанной здесь проточной ячейки номер один, вычитаемой из проточной ячейки.

Во-вторых, важно варьировать продолжительность введения лигандов для достижения одинаковой нагрузки. В отличие от этого, продолжительность инъекции аналита должна поддерживаться постоянной для всех концентраций, используемых для получения количественных данных. Вводится диапазон концентраций аналита.

Здесь представлены инъекции различных концентраций аналита с постоянной длиной инъекции. Различные концентрации аналита вводятся в случайном порядке, а двойные пустые сенсорные граммы выравниваются по оси X перед анализом для получения аффинности и константы скорости. Применяется примерка модели.

Рассчитанная константа диссоциации равновесия для мод взаимодействия BCA составляет примерно три раза по 10 до минус шести моляров при умеренно быстром KA и быстром KD Once освоенных. Эту технику можно сделать уже через несколько часов после просмотра данного видео. Вы должны хорошо понимать, как планировать и проводить эксперимент SPR с использованием интересующего вас белка.