Экстракорпоральное синтеза модифицированных мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека

Общей целью этой процедуры является синтез in vitro модифицированной мРНК для индукции экспрессии белка в клетках. Это достигается путем первичной амплификации плазмидной вставки или кодирующей последовательности ДНК и добавления поли-Т-хвоста из 120 тимидина с использованием полимеразной цепной реакции. Вторым этапом является транскрипция in vitro сгенерированной ДНК в мРНК с полиадениновыми хвостами.

Затем матричная ДНК удаляется с помощью D'S-обработки смеси реакции транскрипции in vitro. Заключительным этапом является обработка произведенной мРНК антарктической фосфатазой для удаления пяти основных фосфатов. В конечном итоге клетки трансфицируются генерируемыми мРНК, липидными комплексами.

Флуоресцентная микроскопия и анализ проточной цитометрии используются для демонстрации синтеза усиленного GFP в клетках. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами вроде вирусного трансфекта является отсутствие интеграции в геном клетки-хозяина, что предотвращает риск онкогенеза. Этот метод может помочь продуцировать отсутствующие или дефектные белки в клетках и может быть использован для вакцинации при лечении генетических нарушений.

А в области регенеративной медицины, демонстрацией процедуры будет заниматься стейнле аспирант из моей лаборатории. Перед началом этой процедуры плазмиды, содержащие необходимые кодирующие последовательности ДНК или CDS, амплифицировали в кишечной палочке и изолировали, как описано в тексте протокола. В данном примере представляющий интерес CDS представляет собой усиленный зеленый флуоресцентный белок или EGFP для одновременной амплификации и добавления полидетализации к CDS EGFP.

Приготовьте смесь для ПЦР, как указано в тексте протокола. Поместите пробирку для ПЦР в амплификатор и запустите протокол циклирования ПЦР, который описан в тексте протокола. Когда ПЦР-реакция будет завершена, очистите ее с помощью имеющегося в продаже набора для очистки ПЦР и разбавьте ДНК 20 микролитрами воды, свободной от нуклеазы.

Чтобы проверить качество продукта ПЦР, выполните электрофорез в ДНК-геле и визуализируйте полосы ДНК на системе визуализации. Четкая полоса ДНК длиной примерно 1100 пар оснований должна быть обнаружена во время транскрипции in vitro или IVT. ДНК, сгенерированная ранее, будет транскрибирована в мРНК.

Приготовьте аналоговую смесь NTP cap, как показано ниже. Тщательно перемешайте аналоговую смесь NTP с помощью вортекса. Затем раскрутите его вниз Кратко соберите реакционную смесь IVT, как описано в этой таблице.

Тщательно перемешайте реакционную смесь IVT, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Затем кратковременно центрифугируйте пробирку для ПЦР, чтобы собрать смесь на дне пробирки. Инкубировать реакционную смесь IVT при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов в термомиксере.

Через три часа удалите матричную ДНК, добавив один микролитр ДНК в реакционную смесь IVT. Хорошо перемешиваем и инкубируем при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Очистите реакционную смесь с помощью набора для очистки РНК и дважды разведите модифицированный MR NA с мембраны спинового столба 40 микролитрами воды, свободной от нуклеазы, модифицированную мРНК, полученную IVT, необходимо обработать фосфатазой для удаления пяти основных трифосфатов, которые могут привести к иммунной активации.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте девять микролитров 10-кратного реакционного буфера антарктической фосфатазы в 79 микролитров очищенного раствора мРНК. Впоследствии добавьте два микролитра антарктической фосфатазы и аккуратно перемешайте образец. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Через 30 минут очистите реакционную смесь с помощью набора для очистки РНК и дважды разведите модифицированную мРНК из мембраны спинового столба 50 микролитрами воды, свободной от нуклеазы. После измерения концентрации модифицированной мРНК отрегулируйте концентрацию до 100 нанограмм на микролитр, добавив воду, свободную от нуклеазы. Проверьте качество синтезированной модифицированной мРНК с помощью РНК-гель-электрофореза и визуализируйте лестницу и запреты мРНК на УФ-транс-осветителе.

Следует обнаружить четкую полосу мРНК длиной примерно 1 100 пар оснований. Подготовить клетки HEC 2 9 3 к трансфекции синтезированной модифицированной мРНК путем двукратного осаждения. Центрируйте пять клеток в лунке 12-луночного планшета Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в клеточном инкубаторе На следующий день клетка должна достичь конфлюенции от 80 до 90%.

Сгенерируйте липосплетение для трансфекции. Приготовьте достаточное количество трансфекционной смеси для всех лунок для трансфекции Каждая лунка 12-луночного планшета требует 2,5 микрограмма модифицированной мРНК, два микролитра реагента для трансфекции липидов и 473 микролитра опции одного. Уменьшите содержание сыворотки среды.

Аккуратно перемешайте компоненты с помощью пипетки в качестве отрицательного контроля. Приготовьте трансфекционную смесь без Mr.NA, инкубируйте трансфекционные смеси при комнатной температуре в течение 20 минут для получения липосоидов. Для переработки.

Промойте клетки 500 микролитрами DPBS на каждого. Хорошо добавьте 500 микролитров трансфекционной смеси в каждую лунку из 12-луночного планшета, инкубируйте клетки в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа через четыре часа, отаскайте трансфекционную смесь и добавьте один миллилитр полной клеточной культуры. Средняя к клеткам в каждой лунке.

Инкубируйте клетки в течение 24 часов в клеточном инкубаторе. Впоследствии проводят флуоресцентный микроскопический анализ клеток с помощью флуоресцентного микроскопа для подготовки клеток к проточной цитометрии. Извлеките из лунок питательную среду для клеточных культур и промойте каждую лунку одним из DPBS без кальция и магния.

Добавьте 500 микролитров TRIPSIN EDTA в лунку, чтобы оторвать клетки от поверхности клеточных культуральных планшетов. Затем добавьте 500 микролитров нейтрализующего раствора трипсина на лунку для инактивации триина центрифугируйте отделенные клетки в течение пяти минут при комнатной температуре, в 300 раз превышающей G. После удаления супината Риза суспендировать небо клетки в 150 микролитрах раствора для фиксации клеток и перенести клеточную суспензию в пробирку проточной цитометрии.

Проанализируйте процент клеток, экспрессирующих EGFP, и интенсивность флуоресценции, используя среднее геометрическое интенсивности флуоресценции. Экспрессия белка с течением времени также оценивается с помощью анализа проточной цитометрии клеток, экспрессирующих EGFP, через один, два и три дня после трансфекции, как описано в тексте протокола, функциональность сгенерированной мРНК EGFP была проверена путем трансфекции клеток HEC 2 9 3. Продукцию EGFP в клетках выявляли через 24 часа после трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.

Здесь контрастное изображение клеток показано рядом с флуоресцентным изображением клеток. Экспрессия EGFP в клетках также была обнаружена с помощью проточной цитометрии через 24 часа после трансфекции. Розовая линия представляет клетки без мРНК, трансфекции, а синяя линия представляет EGFP-положительные клетки.

После трансфекции мРНК EGFP 93,91% всех измеренных клеток были положительными, а среднее геометрическое интенсивность флуоресценции составило 720,16. Продолжительность экспрессии белка в клетках HC 2 93 оценивали путем измерения экспрессии EGFP через один, два и три дня после мРНК. Экспрессия трансфекционного белка была самой высокой в клетках через 24 часа после трансфекции.

Количество уменьшалось в 1,6 раза каждый последующий день, но даже через три дня ячейки содержали EGFP после освоения. Эту методику можно сделать за два дня, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как производить стабилизированную модифицированную мРНК для индукции желаемой экспрессии белка в клетках.