Конфокальной длительной изображений в качестве эффективного метода для Cytocompatibility оценки Стоматологические композиты

Общая цель этой процедуры заключается в использовании 3D конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для покадровой визуализации для качественной и количественной оценки биосовместимости стоматологических композитов in vitro. Это достигается путем предварительного отбора сферических образцов неотвержденного стоматологического композита на втором этапе. Фибробласты десен человека культивируют в присутствии или отсутствии этих композитных экстрактов, а затем клетки помечают окрашиванием живых мертвецов.

Затем генерируются картографические изображения клеточных культур, а для областей интереса создаются наложенные изображения. В конечном счете, различия в поведении клеток в реальном времени, которые происходят в присутствии или в отсутствие тестируемых композитов, могут быть отслежены в соответствии с изменениями зеленых или красных флуоресцентных сигналов, наблюдаемых на изображениях. Основные преимущества этого метода перед существующими методами заключаются в том, что он позволяет осуществлять мониторинг живых клеток в режиме реального времени, не вызывая изменений в клеточной структуре.

После окрашивания клеток или до временного наблюдения не требуется никаких этапов фиксации или сушки. Для приготовления композитного экстракта начните с использования изготовленного на заказ держателя с радиусом в два миллиметра для формирования сферических образцов неотвержденного стоматологического композита. Перенесите образцы в отдельные лунки шестилуночного планшета, содержащего один миллилитр питательной среды, позаботившись о том, чтобы оставить некоторые лунки только со средой для контрольных клеточных культур, а затем расположите светодиодную лампу с квадратической интенсивностью 1070 милливатт в пределах 0,5 миллиметра от образцов.

Отверждение образцов в течение 40 секунд для имитации временного контакта между зубами и неухоженным стоматологическим композитом, а затем инкубация образцов композита в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Меняйте среду каждые три дня и проходите клетки каждые пять дней. Затем, после того как культура достигнет беглости, соберите клетки и вращайте их в течение пяти минут при 90-кратном G и 37 градусах Цельсия.

Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде, а затем, после подсчета клеток, высейте клеточную суспензию при плотности клеток 2,5 умно-10 на четвертую клетку на миллилитр в камерную систему слайдов на ночь при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5%. На следующее утро замените среду в двух лунках предметного стекла камеры одним миллилитром протестированных композитных экстрактов и поместите предметное стекло обратно в инкубатор для визуализации клеток по фокусу. Покадровая съемка.

Сначала пометьте композитные ко-культивируемые и контрольные клетки окрашиванием цитотоксичностью живых мертвых клеток для эукариотических клеток в соответствии с инструкциями производителя. Через 15 минут после окрашивания поместите предметное стекло камеры в темноту в конфокальную интегрированную камеру в условиях культивирования клеток и нагрейте лазеры 473 и 559 нанометров. Затем используйте детектор с недавно разработанным спектром для автоматической установки условий получения изображения для лазера с яркостью 473 нанометра.

Используйте функции кадрирования и масштабирования для выбора области интереса, а затем выберите режим наблюдения. Выберите до пяти типов режимов наблюдения, включая покадровую съемку Zack и мультизональный по мере необходимости, а затем быстро получите пять изображений карты с помощью лазера с яркостью 473 нанометра под объективом 10x как для тестового образца, так и для контрольных ячеек, когда будут получены желаемые изображения. Переключитесь на лазер с яркостью 559 нанометров и получите изображения ячейки при второй флуоресцентной проекции, как показано выше.

В качестве альтернативы можно наложить флуоресцентное и светоконтрастное изображения в выбранной точке на экране X 60 в режиме реального времени, чтобы наблюдать за сохранением изображений в режиме реального времени. Картографические изображения в формате изображений Olympus для анализа сигналов и максимальной проекции составляют 24 бита на пиксель. Затем файлы TIFF используют различные инструменты анализа для измерения профиля интенсивности сигнала и отношения интенсивности между двумя флуоресцентными каналами.

Наконец, проанализируйте различия в передаче сигналов флуоресцентных клеток между двумя группами с помощью соответствующего программного обеспечения. На этих картографических изображениях живых окрашенных клеток TED только в среде или при воздействии композитного экстракта не наблюдалось никаких различий в жизнеспособности клеток через 15 минут после начала периода замедленного действия. Здесь максимальные проекционные изображения контрольных клеток показывают увеличенную судьбу клеток в течение первых 15 минут, а через пять часов в конце периода временного интервала, как наблюдалось, не было существенных изменений флуоресценции в контрольных клетках в течение инкубационного периода.

Клетки, подвергшиеся воздействию сверхнизкой усадки, имели морфологию, аналогичную веретенообразной с контрольными клетками, но демонстрировали небольшое снижение зеленого флуоресцентного сигнала и очень незначительное увеличение красной флуоресценции в конце периода покадровой съемки. Профиль интенсивности окрашенных клеток проиллюстрирован на этих графиках, на которых измеряли интенсивность излучения однофлуоресцентного излучения гомодимера эндотелия кальция на контрольных и композитных облученных клетках с интервалом в один час в течение пяти часов. Существенных различий в передаче сигналов между двумя культурами не наблюдалось.

Коэффициенты жизнеспособности для контрольных и экспонированных композитных ячеек приведены в таблице. Было обнаружено, что в присутствии тестируемого композита процент живых клеток незначительно снижается со 100 до 93,9% после одного часа контакта через пять часов. Наблюдались значительные различия в жизнеспособности клеток между тестируемым композитом ELS, сверхнизкой усадкой и отрицательными культурами клеток контроля, несмотря на отсутствие цитотоксичности композита.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование конфокальной покадровой визуализации является точным и чувствительным методом оценки поведения генеральных фибробластов при контакте стоматологических композитов после их разработки. Этот метод является частным способом для исследователей в области токсикологии изучить цитотоксичность и оценку риска стоматологических материалов, лекарств, химических веществ и других медицинских устройств.