Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга

Общая цель этой процедуры заключается в оценке уровней экспрессии всех генов и образцов из эмбрионального спинного мозга цыплят. Это достигается путем сначала в яйцеклетке порции правой стороны ранних эмбриональных нервных трубок и повторной инкубации эмбрионов до желаемой стадии. Вторым этапом процедуры является рассечение успешно трансфицированных половин нервной трубки в среде, свободной от РНК, и проведение лизиса как можно быстрее.

Третий шаг заключается в выделении РНК и подготовке образцов к библиотеке и высокопроизводительном секвенировании. Последним шагом является обработка наборов данных для удаления артефактов секвенирования. Сопоставьте породы с геномом и назначьте уровни экспрессии каждому гену.

В конечном счете, результаты могут показать дифференциально экспрессируемые гены путем сравнения уровней экспрессии в контрольных и экспериментальных условиях. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение в качестве рассечения нейротрубки. Шаги трудно освоить, потому что мы требуем знакомства с манипуляциями с эмбрионами.

Для этой демонстрации эмбрионы были преобразованы с помощью конструкта, экспрессирующего GFP в нервной трубке. Приготовьтесь потратить два часа, работая с 10 эмбрионами, чтобы собрать от одного до двух микрограммов общей РНК для каждого эмбриона. В свободных условиях РНК соберите эмбрионы с помощью тонких ножниц для препарирования и ложки для сбора SVE, перенесите каждый эмбрион в холод.

DEPC лечится. PBS использовала решение для всех этапов выделения нервной трубки, используя тонкий пинцет для удаления всей области бока эмбриона между зачатками конечностей. Переместите этот участок в свежий холодный раствор тканью тыльной стороной вверх.

С помощью двух тонких стеклянных игл проделайте по три точки на каждой дорсальной боковой стороне эмбриона между нервной трубкой и париальной мезодермой. Теперь введите две стеклянные иглы в центральную перфорацию и раздвиньте их по оси AP. Проделывайте это через каждую перфорацию по мере необходимости, чтобы в конечном итоге отделить паральную мезодерму, удалить и отбросить эту ткань.

Далее переверните эмбрион боком и введите кончики двух пинцетов между нервной трубкой и узловым канатиком. Раздвиньте их вдоль оси AP, чтобы разделить конструкции. Завершите удаление более крупных кусочков медной ткани из нервной трубки, аккуратно закрепив ее пинцетом, одновременно выщипывая излишки мезодермы.

Затем аккуратно переложите нервную трубку в свежий холодный раствор. С помощью стеклянной пипетки с ручным насосом соберите все необходимые нервные трубки и держите их на льду, прежде чем продолжить. Теперь разделите каждую из нервных трубок на две половины.

Вставьте пинцет с острым кончиком в просвет и разорвите кровельную пластину. Затем с помощью пинцета разрежьте напольную плиту и разделите ткань пополам. С помощью флуоресцентного препарирующего микроскопа отсортируйте электропорированные половинки от неэлектропорированных.

Переложите отсортированные половинки нервной трубки в пробирку объемом 1,5 миллилитра со свежим раствором. Переверните эти трубки, чтобы вся ткань опустилась на дно. Затем прокрутите трубки со скоростью 100 GS в течение нескольких секунд.

Затем очень осторожно под ярким освещением отсасывайте снат. Если ткань подтянулась, медленно выбросьте ее и повторите отжим. После того, как половинки нервной трубки будут очищены от раствора, добавьте в трубку 70 микролитров на нервную трубку, половину буфера для лизиса.

Переверните трубку и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 15 минут каждые пять минут, энергично закрутите трубку и продолжайте сбор РНК для очистки РНК Для секвенирования имейте не менее восьми половинок нервной трубки на образец. Другие коллекции нервных трубок лицея, хранящиеся при температуре минус 80 градусов по Цельсию, могут быть объединены в коллекцию. Начните с размораживания их на льду в течение 15-30 минут, а затем завершите размораживание при комнатной температуре.

После размораживания энергично перебейте все образцы и дайте им постоять пять минут. Затем снова переведите образцы в вихревое состояние и центрифугируйте их при давлении 15 000 GS в течение одной минуты. Чтобы избавиться от нерастворимого материала, переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и приступайте к экстракции.

Используя набор для выделения РНК, завершите процесс, ускользнув от РНК в максимально возможной концентрации. Для этого протокола требуется учетная запись на веб-сайте Galaxy, чтобы обеспечить необходимую квоту места. Во-первых, FTP загружает файлы FASTQ на сайт, если только показатели качества уже не закодированы в Shred plus 33.

Сначала подготовьте загруженные наборы данных с помощью инструмента FASTQ groomer в меню NGS QC and Manipulation. В противном случае в разделе атрибуты измените тип файла на отправителя FASTQ. Затем в меню «Контроль качества и манипуляции NGS» используйте инструмент FAST QC для анализа общего качества наборов данных.

Выберите качественный триммер FASTQ в том же меню, чтобы отбросить три основных конца низкого качества. Следует обработать оценку качества 20 или выше. Теперь перейдите к инструменту обрезки в том же меню.

Настройте этот инструмент на отбрасывание операций чтения с менее чем 45 парами оснований. Введите последовательность адаптеров. Отключите опцию отбрасывания операций чтения с неизвестными основаниями и выберите вывод для включения обрезанных и необрезанных последовательностей.

Перейдите к работе с инструментом обрезки последовательностей. Используйте его для обрезки первых оснований чтения, чтобы удалить смещение пяти простых последовательностей, которое обнаруживается с помощью FAST qc. Следующим шагом будет загрузка и распаковка последней сборки генома курицы с сайта генома Illumina I.

Затем загрузите файл в формате faster всего генома и файл аннотации гена в формате GTF в Galaxy History. Теперь сопоставьте показания для каждого образца с геномом, открыв меню анализа N-G-S-R-N-A и выбрав инструмент Top Hat Two. Выберите загруженный файл fasta из Истории галактики в качестве эталонного генома.

Затем выберите инструмент запонок в том же меню, чтобы построить прогнозируемый транскриптом. Для каждого примера выберите файл GTF, который будет использоваться в качестве руководства по аннотациям. Выберите «Выполнить коррекцию смещения с помощью файла FASTA» для данных последовательности и включите параметр «Использовать коррекцию множественного чтения».

Затем объедините все собранные транскриптомы с помощью инструмента объединения манжет. С помощью этого инструмента выберите файл GTF для аннотации ссылок и файл FASTA для данных последовательности. Теперь сравните файлы BAM, сгенерированные top hat two для каждого образца с помощью инструмента TIFF, который все еще находится в меню анализа РНК.

В поле «Расшифровки» выберите транскриптом слияния, созданный с помощью cuff merge, и включите параметры. Используйте множественную коррекцию чтения и коррекцию смещения с помощью файла FASTA для данных последовательности. Следующим шагом является сортировка дифференциальных таблиц Используя столбец значения Q, выберите инструмент сортировки в меню фильтров и сортировки.

Последовательности со значительной разницей между экспериментальными условиями будут иметь наименьшие значения Q в столбце 13. Теперь взгляните на графики покрытия. Во-первых, преобразуйте файлы BAM в файлы диаграмм bed с помощью инструмента преобразования в меню инструментов bed под параметрами, отключите отчетность по регионам без покрытия и выберите обработку склеенных записей как отдельных интервалов.

Также масштабируйте покрытие по коэффициенту, который нормализует все покрытия в эксперименте. Затем конвертируйте полученный файл графика кровати в формат большого парика с помощью инструмента в меню конвертировать форматы и загрузите файл большого парика в качестве пользовательского трека на сервер UCE. На странице браузера генома USCS используйте GAL четыре сборки и поиск генов для визуального охвата наборов данных с помощью описанных методов были собраны нейронные трубки, экспрессирующие пустые векторы PS, для их РНК.

Это было сделано в двух экземплярах, и полученная РНК была очень высокого качества с оптимальным значением RIN 10, как и ожидалось. Глобальное сравнение транскриптомов дублирующихся пустых векторных контрольных групп не показало явной разницы, а коэффициент корреляции Пирсона составил 99 баллов. Кроме того, наблюдалось явное увеличение числа прочтений, картированных на последовательность гена scratch two в экспериментальном образце, экспрессирующем домены цинковых пальцев scratch two.

Таким образом, методы оказались достаточно чувствительными для обнаружения прогнозируемого обогащения. После просмотра этого видео вы сможете изолировать эмбриональную нейротрубку и будете хорошо понимать, как обрабатывать и сравнивать набор данных IC для поиска дифференциально экспрессируемых генов, следуя шагам анализа кремния в разделе 4 протокола.