Методы для кожи телесные повреждения и анализы для заживления ответы в C. Элеганс

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для нанесения раны, и визуализировать реакцию эпидермиса на рану. Этого можно добиться, ранив эпидермис небольшими проколами, вызванными уколами иглой для микроинъекций. Второй метод ранения использует лазерное облучение.

Это может быть выполнено на животных, установленных для микроскопии, и позволяет немедленно визуализировать реакцию на рану. Результаты показывают, что ранение вызывает быстрое повышение уровня кальция в эпидермисе с последующим накоплением актинового кольца вокруг места раны, которое закрывается через несколько часов, тем самым позволяя ране зажить. А показанные здесь методы лазерного ранения в настоящее время являются наиболее широко используемыми методами повреждения кожи у нематоды C Elgan.

Эти методы используются для решения ключевых вопросов в области раневых почек, таких как то, как клетки кожи обнаруживают травму и реагируют на нее. Положите тарелку с молодыми взрослыми червями на лед примерно на полчаса, чтобы замедлить животных. Это оцепенение, вызванное охлаждением, важно для точного ранения иглой.

Поскольку черви обычно двигаются слишком быстро для нанесения ран под стереомикроскопом, посмотрите на червей и с помощью кирки переместите их всех к центру пластины. Затем возьмитесь за вытянутую иглу, как при микроинъекции, с наконечником пипетки объемом 100 микролитров. В качестве иглодержателя поднесите острие иглы к обоим концам червя, избегая половых желез, либо между задней глоткой и внутренней половой железой, либо между задней половой железой и прямой кишкой.

Затем добавьте примерно прямой угол к кутикуле. Сделайте короткий легкий укол, который проникнет в червя на глубину от пяти до 10 микрон. Эти раны от игл также могут повредить внутренние органы, такие как кишечник.

Подождите немного, чтобы увидеть, как клеточное содержимое вытекает из раны. Несколько секунд утечки — это нормально, но большее количество говорит о том, что рана будет смертельной. Визуализировать реакцию раны будет проще всего, если рана сделана в латеральном эпидермальном синцитии или в боковом шве.

При игольчатом ранении критически важно нанести небольшой прокол, а не большой укол. Поскольку лестница может быстро убить червей, необходима практика, чтобы воспроизводимо нанести минимальный ущерб, необходимый для вызова реакции на рану: продолжайте ранить каждое животное одной и той же иглой, пока оно не сломается или не загрязнится. С опытом ранить всех 25 животных на тарелке за пять минут вполне реально точно на нематод.

В этом протоколе используется фемтосегментный лазер, прикрепленный к линии фокального микроскопа с вращающимся диском, или точечное сканирование с использованием фемто-фемтосекундных литров, как в двух фотомикроскопах. Также должно быть достаточно. Начните с того, что соберите 10 молодых людей на шнековой площадке.

Парализуйте их в двух микролитрах капли 12 миллимолярного раствора. Затем накройте их чехлом и подождите несколько минут, пока они парализуются. Важно, чтобы животное было полностью парализовано.

Еще 12 милли не повлияют только на реакцию. Однако можно использовать и другие методы иммобилизации. Убедитесь, что мощность фемтосекундного лазера установлена на 140 милливатт, измеренная перед объективом, а частота повторения лазера составляет 80 мегагерц.

Теперь определите местонахождение червей под конфокальным микроскопом с вращающимся диском с помощью объектива с 100-кратным увеличением и высокой числовой апертурой, направленным на латеральный, передний или задний синцитиальный эпидермис целевого червя, фокусируясь на апикальной поверхности эпидермальной клетки. Посветите лазером на два импульса по 200 миллисекунд, разделенных 20 миллисекундами. Этого должно быть достаточно, чтобы ранить эпидермис.

Подождите немного и понаблюдайте за локальным нарушением цитоплазмы, которое будет проявляться в виде пузырей. При наличии флуоресцентного маркера может наблюдаться локализованное обесцвечивание. Этот протокол использует C-элегантность, которая экспрессирует кальциевые сенсоры в эпидермисе, такие как G Camp 3, а также экспрессирует красный флуоресцентный белок, такой как TD томат, в качестве внутреннего контроля уровня экспрессии трансгенов.

Несмотря на то, что оба метода ранения вызывают повышение кальция для визуализации с помощью конфокальной микроскопии вращающегося диска, лазерное ранение необходимо использовать после получения покадровых изображений с интервалом в две секунды и возбуждением и лазерным воздействием 114 миллисекунд. То же увеличение, которое используется для лазерного ранения, подходит для более длительных курсов времени, например, двухчасовые снимки могут быть сделаны каждые 30 секунд или дольше. Текстовый протокол предлагает процедуры анализа.

В этом протоколе используются черви, которые экспрессируют F-актиновый маркер GFP мозин под контролем эпидермально-специфического промотора, например, call 19 после посева иглы. Раненых червей при температуре 20 градусов Цельсия помещают в инкубатор в течение часа, а затем выводят Закса для визуализации формирования актинового кольца, чтобы сразу после ранения иглой изучить динамику актина, перекладывают раненых животных на шнековую площадку на предметном стекле и обезболивают их лапкой. Затем сделайте снимки животных с помощью обычной конфокальной микроскопии.

Приобретите Zacks с интервалом 0,5 микрометра в течение одного-двух часов, чтобы измерить актиновое кольцо для количественного определения диаметра кольца. Сначала сделайте проекцию максимальной интенсивности стека Z и нарисуйте четыре линейных сканирования под углом 45 градусов друг от друга над MOI GFP и кольцом. Затем рассчитайте диаметр кольца как среднее максимальное расстояние от вершины четырех сканирований для замкнутых колец.

Диаметр определяется как нулевой O, лазерное или игольчатое ранение вызывает быстрое и устойчивое повышение уровня кальция в эпидермисе, как визуализируется с помощью датчика кальция G. Боковой вид эпидермиса в передней части тела показывает лазерную рану, отмеченную буквами X и N DeMars на эпидермальном ядре. Повышение уровня кальция быстро распространяется из области раны Количественная оценка уровней кальция в 2040 и 60 микрон от одного участка раны помогает проиллюстрировать эти ранние кинетики реакции кальция.

Повышение кальция сохраняется в течение десятков минут и ранение иглой надежно. Приводит к образованию f-актиновых колец, которые постепенно смыкаются в местах раны в течение двух часов. Это было визуализировано с помощью вызова P 19 GFP MOI у животных.

Эти кольца реже изготавливаются путем точного лазерного навивки. Диаметр актонового кольца был количественно определен с помощью четырехстрочного сканирования. Количественная оценка сканирования линий показывает, как актиновое кольцо имеет различную интенсивность на разных расстояниях от раны. Место.

Разработка этих методов заживления ран позволила исследователям использовать морскую элегантность в качестве модели для многих аспектов заживления ран, включая врожденные иммунные реакции и закрытие ран. Не забывайте, что фемтосегментные лазеры представляют опасность. Любой, кто работает с фемтосегментным лазером, должен пройти обучение по технике безопасности при работе с лазером.