Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Общая цель этой процедуры заключается в надежной трансфекции человеческого ТГП одного макрофага с высокой жизнеспособностью клеток и отсутствием клеточной активации. Это достигается путем предварительной дифференцировки моноцитов THP one в течение 48 часов. Вторым этапом процедуры является отделение преждевременного ТП одного макрофага.

Третьим шагом является трансфекция клеток IRNA или плазмидной ДНК с использованием нуклеофакторной технологии lonza. Заключительными этапами являются повторный посев и дальнейшая дифференцировка клеток. В конечном счете, успешный нокдаун или сверхэкспрессия генов может быть продемонстрирована с помощью количественной ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и так далее.

Основное преимущество этого метода по сравнению с другими подходами к трансфекции, такими как липофектия, заключается в том, что мы можем достичь высокой эффективности трансфекции в сочетании с высокой жизнеспособностью клеток, и что мы не изменяем функцию и поведение микрофагов. К сожалению, этот метод не подходит для приложений с высокой частотой, так как более интенсивная трансфектация не может быть выполнена за один раз для этого протокола. Культивируют THP в одной клетке RPMI 1640 с 10% FCS и 1% пен-стрептококком L глутамином за 24 часа до трансфекции разделяют клетки и обеспечивают их свежей средой.

На следующий день. Предварительно дифференцируйте клетки путем посева от 10 до 15 миллионов клеток в тканевую колбу площадью 75 квадратных сантиметров со следующими добавками к дополненной среде RPMI, 1% заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 10 нанограммов на миллилитр, PMA и 50 микромолярного бета-меркаптоэтанола через 48 часов, аспирируйте среду и замените ее шестью миллилитрами Аккутана. Один нагрелся до 37 градусов по Цельсию, чтобы отделить клетки.

Инкубируйте их в течение 30 минут во время инкубации. Подготовьте достаточное количество среды для трансфекции и культивирования для ухода за клетками после поражения ядра. Через 30 минут проверьте, что ячейки отсоединены, и осмотрите вокруг.

Если некоторые ячейки все еще прикреплены, осторожно накачайте колбу с помощью микропипетки или отсоедините их с помощью простого перемешивания. Не используйте скребок. Переложите суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте их в течение пяти минут при 300 G и при комнатной температуре, удалите надосадочную жидкость путем аспирации и повторно суспендируйте клеточную гранулу.

В одном миллилитре RPMI, среднем разогретом до 37 градусов Цельсия, подсчитайте клетки и сделайте микромусорные пробирки, содержащие от двух до двух с половиной миллионов клеток, для немедленной трансфекции. Быстрое выполнение этого протокола имеет важное значение. Чтобы избежать потери смертности клеток, убедитесь, что все материалы подготовлены заранее. Сначала центрифуга, все аликвоты трансфекции в течение 10 минут при 250 GS и при комнатной температуре, пока они вращаются, загрузите все нуклеоэффекторы ветеринаров половиной микрограмма плазмидной ДНК или одним микрограммом SI РНК. Используйте высококонцентрированное разведение, чтобы они занимали минимальный объем ветеринара.

Теперь отсасывайте надосадочную жидкость только из одной из аликвот клеток. Суспензируйте клетки до 100 микролитров в растворе нуклеофактора. Не позволяйте клеткам оставаться под воздействием раствора более 15 минут.

Передайте клетки ветеринару Q и перемешайте их легкими постукивающими движениями. Затем трансфектируйте клетки с помощью программы Y 0 0 1 на модели 2 нуклео фактора B. С помощью одноразовой пипетки переместите электропорированные клетки в реакционный флакон и сразу же добавьте в клетки полмиллилитра заранее предупрежденной трансфекционной среды.

Теперь продолжайте повторять процесс с каждой аликвотой клеток одну за другой, пока все они не будут трансфицированы. После завершения поражения ядер переносите каждую трансфекцию клеток в лунку шестилуночного планшета с 2,5 миллилитрами теплой трансфекционной среды. Тщательно перемешайте каждую лунку с помощью микропипетки.

Дав всем загруженным планшетам инкубироваться в течение четырех часов, проверьте состояние клеток под микроскопом. Через четыре часа большинство клеток следует приклеить к пластине, если это необходимо. Самое большее.

Еще один час инкубации обеспечит достаточную работу по одной скважине за раз. Отсасывайте трансфекционную среду из прилипших клеток и заменяйте ее таким же объемом теплой питательной среды. Будьте осторожны, чтобы не отсоединить ячейки во время этого шага.

Теперь инкубируйте клетки столько, сколько потребуется. При необходимости заменяйте среды каждые 48 часов, планируйте применять процедуры так, чтобы они заканчивались, когда трансфицированная ДНК или РНК достигает своего пикового эффекта. При обработке клеток эффекторами используйте бессывороточную среду без ПМА и без бета-меркаптоэтанола.

Будьте осторожны, чтобы клетки не инкубировались более 24 часов без сыворотки. Протокол использовали для трансфекции, оценивали макрофаги THP one с клеточной морфологией IRNA. По данным проточного цитометрического измерения.

Частота апоптоза и некроза в клетках была низкой как в трансфицированных, так и в контрольных культурах. Тем не менее, тщательные подсчеты показали, что как апоптоз, так и некроз были немного выше для трансфицированных образцов. Это может быть связано с тем, что трансфицированные макрофаги THP one труднее отделить от планшетов, чем трансфицированные клетки ЕНТ.

В целом, частота трансфекции была выше 90%, что было проанализировано с помощью проточной цитометрии. Эффективность флуоресцентной трансфекции S-I-R-N-A также подтверждена флуоресцентной микроскопией. Функциональность трансфекции была показана генетическим нокдауном экспрессии IL 10 RB.

Использование короткой интерферирующей РНК После освоения трансфект может быть выполнен в течение одного-полутора часов, если он выполнен правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что питательная среда оказывает значительное влияние на производительность. Об этом прописано в текстовом протоколе.