Экспериментальные и биоинформатика Протокол Секвенирование РНК Анализы ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИХ диапаузы в Азиатско тигровый комар, Кусака бело-пёстрый

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении транскрипционных компонентов фотопериодической диапаузной реакции. У немодельных комаров восьмидесятых годов этого можно добиться путем получения биологически реплицированных образцов диапаузных и недиапаузных яиц с помощью различных фотопериодических обработок. В качестве второго шага РНК извлекается из каждого репликата для высокопроизводительного секвенирования РНК.

Затем последовательности РНК обрабатываются вычислительным методом, чтобы собрать их в конги и аннотировать. В конечном счете, вариации экспрессии генов в ответ на фотопериоды, индуцирующие диапаузу, по сравнению с фотопериодами, не вызывающими диапаузу, могут быть выведены из MAP Ридса в сборку РНК. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микролучевой анализ, заключается в том, что для получения глобальных оценок экспрессии генов в ответ на условия диапаузы не требуются априорные генетические ресурсы, такие как последовательность генома или микрочип

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологической геномики, например, какова транскрипционная основа DPO или других ключевых экологических адаптаций у немодельных организмов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, поскольку может быть трудно получить достаточное количество диапаузных и не-DPO яйцеклеток, а последующий биоинформатический анализ может быть сложным. Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили, что технологии высокопроизводительного секвенирования ДНК становятся все более доступными, и предложили удобный метод получения профилей экспрессии всего генома у немодельных организмов перед началом процедуры.

Установите два фотопериода с программируемым освещением на 21 градус Цельсия для оптимального выражения диапаузы и относительной влажности примерно 80% Запрограммируйте один кабинет для фотопериода без диапаузы с темным циклом 16 8 светлых темных циклов, а другой для диапаузы, вызывающей восемь световых темных циклов с включенным светом одновременно, чтобы оба кабинета синхронизировали циркадное время между фотопериодами. Затем погрузите яичную бумагу для соответствующего количества яиц в 500 миллилитров деионизированной воды и добавьте один миллилитр молотого собачьего корма и соленую пищу для креветок. Накройте емкость сеткой, обложив ее резинкой, чтобы она оставалась на месте.

Затем инкубируйте яйца в 16 восьми светлых темных длинных дневных фотошкафах в течение примерно 24 часов. На следующий день перенесите около 30 вылупившихся личинок на группу в отдельные чашки Петри 10 на 10 на два сантиметра, наполненные 90 миллилитрами деионизированной воды. Каждые 48-72 часа перекладывайте личинок в чистую посуду, подкармливая их свежей пищевой кашицей при каждом переносе.

Примерно через шесть дней выстелите дно трех-четырех взрослых клеток для каждой обработки влажной фильтровальной бумагой и смочите фильтровальную бумагу достаточным количеством деионизированной воды, чтобы увеличить местную влажность в клетке, избегая при этом стоячей воды. Обратите внимание на период съемки, номер реплики, дату начала клетки и другую информацию, относящуюся к эксперименту, с помощью перманентного маркера на боковой стороне клетки. Затем через день в течение 10 дней перекладывайте пюй в маленькие чашки с чистой водой не более 50 пуй на 25 миллилитров воды в соответствующие для эксперимента клетки взрослые клетки и помещайте органический изюм на верхнюю сетку клетки, чтобы обеспечить сахаром появившихся взрослых особей. Наполните темные 50-миллилитровые стаканчики, выстланные текстурированным небеленым бумажным полотенцем, наполовину деионизированной водой и поместите по одному стаканчику в каждую клетку для сбора и хранения яиц.

Замените бумагу для яиц в каждой клетке свежей бумагой, положите только что удаленные бумаги в чашки Петри и храните их в восьми 16 светлых темных шкафах для коротких дней для фотографий с периодом времени, чтобы избежать неправильного воздействия на хранение яиц. Примерно через 48 часов после сбора высушите бумагу для яиц на открытом воздухе, чтобы она была мягкой и слегка влажной на ощупь, но не настолько влажной, чтобы бумага потемнела от воды или стимулировала вылупление. Чтобы измерить случаи диапаузы, запишите количество яиц на каждой яичной бумаге.

Затем полностью погрузите отдельные листы бумаги в чашку Петри объемом 90 миллилитров с примерно 80 миллилитровыми деионизированными водами. Чтобы стимулировать их вылупление, добавьте примерно 0,25 миллилитра пищевой кашицы, а затем через 24 часа перенесите чашку Петри на черную поверхность. Теперь поместите источник света с одной стороны от него, личинки будут удаляться от света, что позволит четко определить первую особь в личинках звезд

Используйте пипетку для удаления каждой личинки после подсчета, чтобы предотвратить повторный подсчет особей. Затем положите яичные листы в новую чашку Петри, чтобы они высохли. После подсчета второй партии вылупившихся птенцов через неделю поместите бумаги для яиц с оставшимися невылупившимися яйцами в новые 90-миллилитровые чашки Петри с примерно 80 миллилитровыми свежими отбеливающими растворами, следя за тем, чтобы бумаги были полностью погружены в отбеливающий раствор.

Оставьте бумаги под вытяжным шкафом на ночь, а затем на следующий день с помощью светового микроскопа подсчитайте количество невылупившихся яиц. Если яйцо эмбрионировано, оно будет иметь грязно-белый цвет, а глаза будут выглядеть как две маленькие черные точки друг напротив друга на дорсальной стороне. Для начала тщательно очистите стол раствором для обеззараживания РНК, чтобы удалить все остаточные нуклеазы и избежать деградации РНК.

Затем используйте щетку из верблюжьей шерсти, чтобы расчесать не менее 400 яиц комаров, содержащих развивающиеся эмбрионы во время развития. Точка интереса в стеклошлифовальных машинах. В вытяжной шкаф добавить один миллилитр триола и измельчить яйца до полного их измельчения, а затем провести экстракцию РНК в триоле с последующим осаждением изопропанола согласно инструкции производителя.

Теперь используйте до одного микролитра Dns на 10 микрограммов РНК в 50 микролитрах реакции в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия в соответствии с инструкциями производителя. Далее инкубируйте реакцию в пяти микролитрах взвешенного реагента для инактивации ДНК в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно вортексируйте суспензию трижды за период инкубации.

Затем центрифугируйте экстракты РНК в течение 1,5 минут в 10 000 раз G и Eloqua, РНК-содержащие надосадочные жидкости, в свежие пробирки для секвенирования. Наконец, в сопроводительном тексте приведены подробные сведения о том, как обрабатывать полученные данные секвенирования следующего поколения от чтения, подготовки, сборки и аннотации до анализа дифференциальных выражений. На этом первом рисунке флуориметрия двух репрезентативных образцов РНК показывает две полосы примерно с 2000 нуклеотидами.

Рибосомная РНК насекомого 28 s состоит из двух полинуклеотидных цепей, удерживаемых вместе водородными связями, которые легко разрушаются при кратковременном нагревании или агентах, разрывающих водородные связи. Полученные два компонента имеют примерно тот же размер, что и 18 s рибосомальная РНК во втором образце РНК. В этом репрезентативном эксперименте можно наблюдать высокие уровни деградации. Фотопериодическая обработка репрезентативной группы комаров albopictus привела к высокому уровню диапаузы у комаров, выращенных в течение короткого дня, и низкому уровню диапаузы у комаров, выращенных в течение длительного дня.

Несмотря на то, что среди репликантов были некоторые вариации, например, в группе короткого второго дня наблюдалось более низкое количество инцидентов диапаузы, чем у других репликантов. В результате цифровой нормализованной сборки Тринити было получено 76 377 контигов со средней длиной конига 1020 3,1 и максимальной длиной контига 20 892. Обратите внимание, что распределение длин конти сильно смещено в сторону более коротких контигов.

Это типично для сборки транскриптома Denovo. На этом заключительном графике анализ дифференциальной экспрессии из аналогичного рабочего процесса эмбрионов, выращенных в условиях, вызывающих диапаузу, через 11 и 21 день после яйцеклетки выявил 3 128 дифференциально экспрессируемых генов между этими двумя временными периодами. После освоения эта техника может быть завершена через шесть-восемь месяцев после анализа божественной информатики генерации тканей, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что успех на каждом этапе должен быть проверен, прежде чем переходить к следующему шагу. Например, подтвердите, что в экспериментальных условиях были получены DPA и недиапаузные яйцеклетки, прежде чем проверять целостность РНК После этой процедуры. Другие методы, такие как количественный R-T-P-C-R или сравнительный геномный анализ, могут быть выполнены для ответа на дополнительные вопросы, касающиеся тканей или развития, специфической экспрессии интересующих генов и/или процессов молекулярной эволюции.

Не забывайте, что работа с триолом может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать такие меры предосторожности, как использование перчаток, лабораторного халата и вытяжного шкафа.