Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

Общая цель этой процедуры заключается в анализе миграционного поведения клеток в трехмерной среде. Во-первых, встраиваем интересующие клетки в трехмерную коллагеновую решетку. Затем запишите движение клеток с помощью покадровой видеомикроскопии, определите параметры миграции с помощью компьютерного отслеживания клеток и проанализируйте данные отслеживания клеток с помощью программного приложения для работы с электронными таблицами.

В конечном счете, этот метод может быть использован для исследования того, какие факторы и пути передачи сигналов регулируют миграцию раковых клеток или нормальных клеток, таких как лейкоциты, лимфоциты и стволовые клетки в контексте рака. Таким образом, знания о миграции клеток, модулирующих факторах и связанных с ними путях транссекции сигнала могут быть полезны для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на нарушение миграции опухолевых клеток и распространение метастазов. Для миграционных камер быстро смажьте два слоя расплавленного парафина, вазелиновой смеси до середины предметного стекла, добавьте крышку, проскользните и запечатайте двумя слоями парафинового воска, вазелинную смесь.

Затем поместите миграционные камеры в вертикальное положение в штатив до 1,5 миллилитровых реакционных пробирок. Добавьте 20 микролитров клеточной суспензии для коллагеновой суспензии. Соедините 50 микролитров 10 XMEM и 27 микролитров 7,5% раствора гидрокарбоната натрия тщательно перемешайте.

Затем добавьте 375 микролитров жидкой суспензии коллагена и тщательно перемешайте до светло-фиолетового цвета, указывающего на pH 7,5. Теперь добавьте 100 микролитров окончательной коллагеновой суспензии к 50 микролитрам клеточной суспензии и тщательно перемешайте, отмечая при этом инициацию коллагенового волокна. Полимеризация. При pH 7,5 перенесите смесь в миграционные камеры.

Осторожно постучите по миграционной камере, чтобы равномерно распределить смесь клеток коллагеновой суспензии на дне камеры миграционной цепи. Поместите миграционные камеры в вертикальное положение на решетку и инкубируйте в течение 30 минут. Когда решетка полимеризованного коллагена станет слегка мутной, но все же светло-фиолетового цвета, заполните миграционные камеры соответствующей средой и запечатайте миграционную камеру парафином.

Смесь вазелина. Отрегулируйте нагреватель предметного стекла микроскопа на 37 градусов Цельсия с помощью 10-кратного увеличения на миграционной камере. Сосредоточьтесь примерно на 50 или более ячеек в поле зрения.

Записывайте миграцию ячеек в режиме покадровой съемки с помощью многокамерного программного приложения для видеонаблюдения. Сохраните видеоролики о миграции ячеек в файле соответствующего формата. Свяжите видеофайлы миграции клеток с базой данных, содержащей вспомогательную информацию, такую как тип клетки и условия эксперимента.

Затем проанализируйте фильмы миграции клеток с помощью соответствующего программного приложения для отслеживания клеток для объективного анализа. Случайным образом выбрать клетки для анализа, не зная, являются ли клетки миграционно-активными в целом, определить около 60 координат XY на клетку в типичном эксперименте по миграции клеток. В случае деления клетки случайным образом выберите одну дочернюю клетку, за которой вы будете следить в отслеживании.

Анализируйте данные отслеживания ячеек с помощью соответствующего программного приложения, например программы для работы с электронными таблицами, чтобы рассчитать общее расстояние, на которое мигрировала ячейка. Умножьте сумму числовых значений пикселей на поправочный коэффициент для преобразования в микроны. Определите ячейки, которые мигрировали меньше порогового значения в 25 микрон, как неподвижные ячейки и замените числовые значения запятой.

Затем рассчитайте локомоторную активность в процентах от количества клеток отслеживаемой популяции клеток, которые переместились между двумя временными точками. Кроме того, рассчитайте время активного движения в процентах от общего времени миграции клетки по отношению к временному интервалу периода наблюдения. Затем рассчитайте статистическую значимость с помощью U-теста Уитни и отобразите данные миграции клеток.

Типичный файл данных отслеживания ячеек похож на таблицу, где каждый столбец обозначает одну отслеживаемую ячейку. Строки содержат позиционную информацию о движении клеток. С течением времени двигательное поведение клеток можно охарактеризовать по средней локомоторной активности анализируемой популяции клеток, а также по времени активного движения.

В этом примере показана миграционная активность 120 клеток из четырех независимых экспериментов. Каждый ромб указывает на то, что ячейка переместилась как минимум между двумя временными точками. Серые линии различают движущиеся и неподвижные клетки.

Параметр активности локомотива может быть отображен в виде диаграммы XY или ящичковой диаграммы. Чтобы визуализировать динамику анализируемой популяции клеток, гистограмма эффективно показывает время активности тех же клеток. Этот анализ миграционного поведения клеточных линий MDA HER2 и M-D-A-N-E-O указывает на то, что обе клеточные линии проявляли сходную спонтанную локомоторную активность.

Параметр «Активное время» выявил несколько большее количество спонтанно движущихся клеток M-D-A-H-E-R по сравнению с клетками рака молочной железы M-D-A-N-O. Стимуляция 100 нанограммами на миллилитр EGF привела к значительному увеличению миграционной активности MDA HER2, измеряемой количеством движущихся клеток и временем активного движения. Интересно, что клетки M-D-A-N-E-O мигрировали в ответ на стимуляцию EGF и демонстрировали смещенный во времени активный паттерн: обработка фосфолипазой c гамма-1 ингибитором UC 3 1 22 снижала как спонтанную, так и индуцированную EGF миграцию как M-D-E-E-R two, так и MDAN.

клетки ЭЭО. Анализ активного во времени параметра показал, что обработка клеток ЭЭО MDAN двумя микромолярами U 7 3 1 2 2 привела к заметному снижению локомоторной активности, в первую очередь за счет увеличения количества неподвижных клеток. После освоения миграции лимфоцитов и лейкоцитов в трехмерные коллагеновые буквы и мент может быть зарегистрирована примерно за два часа, в то время как опухолевые клетки регистрируются в течение ночи.