Подготовка крови культуры Пелле для быстрого идентификации бактерий и чувствительности к антибиотикам

Общая цель этой процедуры заключается в приготовлении бактериальной гранулы из положительной культуры крови, которая может быть использована в качестве образца для различных применений. Это достигается путем смешивания положительного результата посева крови со стерильной водой после центрифугирования. Гранула ресуспендирована в хлориде аммония, чтобы заразить эритроциты после второго раунда центрифугирования.

Гранула снова суспендируется в воде. Заключительным этапом является использование полученной гранулы для идентификации бактерий с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации, времени пролета, окрашивания по Граму, тестирования чувствительности к антибиотикам и/или тестов на основе ПЦР. В конечном итоге полученные результаты могут быть быстро переданы клиницистам для улучшения исхода лечения пациентов, страдающих от инфекций кровотока.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как бактериальное субкультурирование положительных культур крови, заключается в снижении идентификации бактерий примерно на 6-24 часа и сокращении времени до получения результатов на устойчивость к антибиотикам примерно на 24 часа. Этот метод может помочь быстро адаптировать лечение антибиотиками и улучшить исход лечения пациентов, страдающих инфекциями кровотока. Хотя этот метод может быть применен к обычным методам идентификации, таким как OV, и к традиционным подходам к тестированию устойчивости антимикробных препаратов, он также может быть применен к новым технологиям, направленным на ификацию факторов VUL и/или резистентных механизмов, таких как активность ESBL и CARBAPENEMASE.

Визуальная демонстрация этого метода важна, поскольку бактериальный препарат PAL имеет решающее значение для получения достаточного количества микробного материала для последующих применений, демонстрировать процедуру будут Кристиан Дюрель, Мария Кортези, Мария Ти и Ким Гиза, все они являются лаборантами из моей лаборатории. Простерилизуйте крышку для посева крови, добавив 70% этанола на крышку флакона и сожгите ее. Затем переместите флакон в колпак с ламинарным потоком.

Соберите пять миллилитров посева крови с помощью игольчатого шприца 20 калибра. Затем добавьте пять миллилитров культуры крови в центрифугу объемом 50 миллилитров, содержащую 45 миллилитров стерильной воды, и перемешайте образец. Центрифугируйте образец при давлении 1000 G в течение 10 минут.

При комнатной температуре надосадочную жидкость удалить с помощью лабораторного вакуумного насоса. Затем повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре самодельного хлорида аммония. Лизирующий раствор.

Разбейте гранулу путем соскабливания и вортекса перед центрированием образца при давлении 140 г в течение 10 минут При комнатной температуре после центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, которая в основном содержит остатки эритроцитов. Если в грануле остался геморрагический Резус, суспензируйте гранулу в двух миллилитрах стерильной и дистиллированной воды для дальнейшего удаления вшей из остаточных эритроцитов и промыть гранулу после центрифугирования пробы, как и раньше, выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах воды и закрутите пробирку для непосредственной идентификации из гранулы крови. Сначала переложите один микролитр гранул на целевую пластину MALDI и дайте ей высохнуть на нагревательной платформе с температурой 42 градуса Цельсия.

Посыпьте образец одним микролитром 70% муравьиной кислоты и дайте ему высохнуть на нагревательной платформе. Далее насыпьте образец одним микролитром Maldi Matrixx и снова дайте ему высохнуть на нагревательной платформе. Перейдите к анализу maldi TOF MS с помощью системы MALDI TOF MS, как описано производителями.

Если идентификационный балл недействителен на уровне вида, проведите экстракцию белка из образца гранул крови, сначала смешав 20 микролитров гранулы с одним миллилитром 70% этанола. Затем центрифугируйте образец при давлении 13 000 G в течение двух минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 25 микролитров 70% муравьиной кислоты и 25 микролитров 100% ацетонитрила в вихрь гранул для энергичной ресуспендации гранулы после центрифугирования при 13 000 G в течение двух минут. При комнатной температуре перелейте один микролитр надосадочной жидкости на целевую пластину MALDI и дайте ему высохнуть на нагревательной платформе с температурой 42 градуса Цельсия.

Для проведения идентификации бактерий и тестирования на чувствительность к антибиотикам или сначала подготовьте пластиковую пробирку, содержащую три миллилитра стерильного 0,45% раствора натрия хлорида, совместимого с автоматизированной микробной системой. Добавьте в раствор достаточный объем гранулы культуры крови и сделайте вихрь для получения бактериальной суспензии, соответствующей мутности по шкале Макфарланда от 0,6 до 0,8, измеренной с помощью денситометра. Далее сделайте прививку автоматическим грамположительным или грамотрицательным картам для идентификации.

Также инокулируйте автоматизированные карты ST для тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам грамположительных кокков и грамотрицательных бактерий в соответствии с описанием производителя. Для проведения испытаний на чувствительность к противомикробным препаратам методом дискового диффузионного анализа. Сначала приготовьте стеклянную трубку, содержащую три миллилитра стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия.

Затем добавьте в раствор достаточное количество гранул культуры крови для получения бактериальной суспензии, соответствующей мутности по шкале Макфарланда 0,5, измеренной на денситометре. Ввергните бактериальную суспензию в вихрь, чтобы инокулировать бактериальную суспензию. Сначала окуните стерильный ватный тампон в бактериальную суспензию и аккуратно удалите лишнюю жидкость, повернув тампон на внутренней стенке стеклянной трубки.

Затем бактериальную суспензию равномерно распределить по всей поверхности Мюллера. Хинт и шнек или шнек Мюллера и шнек для привередливых организмов путем взятия мазка в трех направлениях или с помощью автоматизированного ротатора пластин для нанесения антимикробных дисков на инокулированные шнековые пластины. Во-первых, плотно приложите диски к поверхности высушенных инокулированных пластин шнека вручную или с помощью дискового дозатора чувствительности.

Затем инкубируйте планшет при соответствующей температуре и атмосфере, как описано в методе дисковой диффузии Европейского комитета по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам для проведения автоматизированного диагностического теста на основе ПЦР. Во-первых, с помощью микропипетки переведите 50 микролитров гранулы культуры крови во флакон с образцом реагента, входящий в комплект автоматизированного диагностического набора MSA на основе ПЦР. Затем переведите флакон на 20 секунд с помощью микропипетки объемом в один миллилитр.

Выдавите образец в отверстие для образцов картриджа. Вставьте картридж в автоматизированную систему ПЦР и начните анализ, как описано производителем в лаборатории Лозанны. Результат напрямую проверяется и передается врачам благодаря возможности подключения автоматизированной системы ПЦР, используемой к системе лабораторного интерфейса или ЛИС.

Если результат неверный, мы рекомендуем повторить анализ после десятикратного разведения бактериальной гранулы. Поскольку это часто связано с ингибиторами ПЦР, гемолиз хлорида аммония позволил получить гранулу культуры крови очень высокого качества с небольшим количеством остатков эритроцитов по сравнению с отрицательным контролем без хлорида аммония. Окрашивание по Граму положительного посева крови на Эшер Коли Коагулазу, отрицательный стафилококк на голову и стрептококк диск AE проводили до и после подготовки посева крови.

Приготовление бактериальных гранул из гранул при таком подходе позволяет концентрировать микроорганизм примерно в 100-1000 раз. В целом, существует несколько последующих применений, которые могут быть выполнены, начиная с гранул культуры крови, и все они выигрывают от сокращения времени получения результатов без снижения чувствительности и специфичности по сравнению с анализами, проводимыми на изолированных колониях. После того, как паштет будет освоен, его приготовление может быть выполнено примерно за 30 минут, если оно правильно выполнено.

Не забывайте, что работа с бактериологическим исследованием крови может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в перчатках и под капюшоном.