Одноместный самолет Освещение модуль и Micro-капиллярной подход для широкого поля микроскопа

Общая цель этой процедуры заключается в проведении одноплоскостной световой микроскопии с использованием модуля возбуждения светового листа для инвертированных микроскопов и применении его к трехмерным сфероидам клеток. Это достигается путем первого использования пипетки для переноса клеточного сфероида из лунки микротитровальной пластины во вторую лунку для инкубации после промывки. Затем S-сфероид вводится в прямоугольный капилляр.

Вторым шагом является установка модуля подсветки светового листа на опорную пластину позиционирующего стола инвертированного микроскопа. Далее капилляр, содержащий стероид, помещается в специальный держатель для образца для микроскопии. Последним шагом является установка согласования между световым листом и фокальной плоскостью объектива микроскопа в тракте обнаружения.

В конечном счете, трехмерные флуоресцентные измерения могут быть выполнены путем изменения фокальной плоскости внутри сфероида клетки для получения информации об отдельных изображениях или Zacks о поглощении лекарств или структуре S-сфероида. Основное преимущество этой методики перед существующими светолистовыми микроскопами заключается в том, что она является экономичной и очень универсальной, поскольку состоит из модуля, который может быть адаптирован к существующему микроскопу и обеспечивает большую степень свободы для исследований. Применение этого метода распространяется на исследования лекарств и агентов, используемых для терапии и диагностики, в частности, поскольку адаптация микрофлюидной системы позволяет исследовать быстрые процессы в условиях потока.

Теперь этот метод возбуждения в сочетании с любым методом обнаружения может дать представление о стероидах живых клеток при низких дозах освещения. Он также может быть применен к другим живым системам, таким как ципрорыбы, эмбрионы артил, а также к образцам оптических тканей CLE. Для начала добавьте 50 микролитров нагретого аэроса 1,5 в питательной среде в каждую лунку планшета на 96 лунок и дайте ему застыть в течение одного-двух часов.

Затем засейте около 150 MCF семи клеток рака молочной железы в каждую лунку подготовленного 96-луночного планшета с общим S в течение пяти-семи дней, до диаметра от 200 до 300 микрометров в инкубаторе при 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия. Затем инкубируйте клеточные стероиды с антрациклиновым антибиотиком доксорубицина гидрохлоридом в течение шести часов в концентрации от двух микромоляров до восьми микромоляров в культуре. Среда После инкубации промойте OID клеток культурой, средой или раствором соли баланса Эрла перед микроскопией.

Используйте инвертированный микроскоп и установите модуль одноплоскостной световой микроскопии или модуля возбуждения СЗМ на опорную пластину позиционирующего стола. Оснастите микроскоп объективом микроскопа с 10-кратным или 20-кратным увеличением и соответствующим фильтром длинных частот в тракте обнаружения микроскопа. Затем установите интегрирующую камеру в порт обнаружения микроскопа.

Используйте параллельный пучок лазера или лазерного диода с длиной волны возбуждения предпочтительно 470 нанометров и приложите его к спиновому модулю. Далее поверните цилиндрическую линзу на 90 градусов, что переводит световой лист в вертикальное положение для осевой регулировки талии луча светового листа. Поместите в держатель образца капилляр, содержащий жидкость с флуоресцентным красителем.

Прикрепите держатель образца с капилляром к позиционирующему столу микроскопа. Выровняйте положение капилляра таким образом, чтобы он был центрирован и талия луча светового листа была в фокусе. Отрегулируйте перетяжку луча путем изменения осевого положения самой цилиндрической линзы.

После регулировки поверните объектив назад. Поместите клеточный стероид отдельно или группами в прямоугольные капилляры из босиликатного стекла с внутренним сечением 600 на 600 микрометров и толщиной стенки 120 микрометров. Для этого большим и средним пальцами поставьте пустой капилляр в вертикальное положение и запечатайте верхнее отверстие указательным пальцем.

Поднесите нижнее отверстие вплотную к сфероиду клетки в окружающей его жидкости, выпустите указательный палец из верхнего отверстия жидкости со стероидом внутри. Он будет немедленно впитан капиллярными силами. Отрегулируйте положение S-сфероида в заполненном капилляре под действием силы тяжести.

В качестве альтернативы можно ввести стероид в капилляр с помощью пипетирования. Следите за тем, чтобы отверстие кончика пипетки было, с одной стороны, достаточно большим для размера сфероида S, а с другой стороны, меньшим или равным по размеру внутреннему диаметру капилляра. Далее поместите капилляр, содержащий S-сфероиду, в специальный держатель для образцов из микроскопии.

Прикрепите держатель образца с капилляром к позиционирующему столу микроскопа и выровняйте положение клеточного стероида таким образом, чтобы он был центрирован и сфокусирован. Установите согласование между световым листом и фокальной плоскостью линзы объектива микроскопа в тракте обнаружения, регулируя положение отражательного зеркала и цилиндрической линзы. Заполните капилляр сывороткой эмбриональной икры или FCS на 30 минут, чтобы поддержать последующую клеточную адгезию клеточного стероида к внутренней поверхности стекла.

Дайте оставшемуся покрытию FCS в обедненном капилляре высохнуть в течение как минимум 12 часов после введения клеточного стероида в капилляр, покрытый FCS. Как и раньше, оставьте капилляр в инкубаторе еще на два-четыре часа, чтобы вызвать клеточную адгезию стероида. Затем настройте flx часть микрофлюидной системы, включая ловушку для пузырьков.

С помощью перистальтического насоса заполните поверхность трубки питательной средой, содержащей флуоресцентный краситель, лекарственный препарат или средство. Сначала прижмите капилляр без пузырьков к трубке оттока, а затем прижмите другую сторону капилляра к дренажной трубке. Настройте температуру жидкости на водяной бане на нужное значение.

Затем отрегулируйте перистальтический насос на желаемую скорость насоса. Соберите перекачиваемую жидкость в приемник с помощью системы с разомкнутым контуром для сбора и анализа данных. Установите мощность лазера и время интеграции для получения изображения.

Установите приращение для стека ZS на значение от пяти до 10 микрометров, что является предпочтительным для трехмерного анализа данных. Поскольку толщина светового листа составляет около 10 микрометров, приступают к выполнению измерений одиночных изображений или изображений Закса путем изменения фокальной плоскости внутри клетки стероида. Показано сканирование семиклеточного стероида mc, предварительно инкубированного с восьмимикромольным доксорубицином в течение шести часов.

Изображения дают подробную информацию о клеточном поглощении и распределении доксорубицина и его деградации. Продукт внутри внешнего клеточного слоя стероида красный флуоресцентный доксорубицин в основном локализуется в ядре, тогда как во внутренних областях сфер зеленый флуоресцентный цвет, представленный продуктом распада, становится доминирующим в клеточной мембране. Поглощение химиотерапевтического препарата доксорубицина в нативных семи клетках рака молочной железы человека S показано для одного клеточного слоя, выбранного с помощью spm.

При применении двух микромоляров и питательной среды в проточной системе красная и зеленая флуоресценция доксорубицина и продукта его деградации непрерывно увеличивалась при применении двух микромолярных доксорубицинов в питательной среде в проточной системе, красная и зеленая флуоресценция доксорубицина и продукта его деградации непрерывно увеличивалась. После мастеринга требуется всего несколько минут от монтажа модуля удаления светового листа до записи флуоресцентных изображений 3D-образцов. При измерении и определении условий потока очень важно убедиться, что образец прилипает к внутренней поверхности капилляра и не допускать попадания на образец пузырьков воздуха, которые могут отделить его от капилляра.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о световой листовой микроскопии с универсальным модулем, адаптируемым к различным микроскопам.