От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить закон диффузии липидов и белков в мембранах живых клеток. Во-первых, функция разброса точки микроскопа калибруется путем визуализации наноскопических флуоресцентных шариков. Затем векторы на основе липосом, включая представляющую интерес молекулу с флуоресцентной меткой, получают и вводят в живые клетки либо путем трансфекции, либо путем прямого включения.

Быстрая визуализация плазматической мембраны живой клетки выполняется с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением. Наконец, вычисляется корреляционная функция и извлекается закон молекулярной диффузии с помощью гауссова аппроксимации. Полученные данные.

Определите режим движения исследуемого липида или белка. Основное преимущество этой методики по сравнению с традиционным подходом восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания или классической одноточечной флуоресцентной корреляционной спектроскопии заключается в том, что она позволяет измерить закон молекулярной диффузии. Мы знаем приоритетное знание системы.

Также вопреки классическим методологиям отслеживания одиночных частиц. При этом измеряется смещение макулы без необходимости извлечения траекторий частиц. Как следствие, этот металл может быть легко использован в сочетании с относительно условными и плотными молекулами, как, например, генетически кодируемые флуоресцентные белки.

В целом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной молекулярной биологии, такие как как движение белка или липидов регулирует структуру плазматической мембраны и функциональную организацию. аспирант лаборатории. Начните этот протокол с калибровки функции распространения точки системы визуализации. Начните с разбавления 10 микролитров раствора флуоресцентных шариков в 90 микролитрах дистиллированной воды, предварительно добавленной в центрифужную пробирку объемом 500 микролитров.

Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 20 минут в сауне с помощью скальпеля, отрежьте квадратный кусок размером один сантиметр из 3% розового геля AGA и поместите его в чашку Петри. Нанесите 10 микролитров разведенного раствора флуоресцентных шариков на верх геля. Затем с помощью щипцов переверните кусочек геля в двухсантиметровую стеклянную чашку Петри.

Опять же, с помощью щипцов. Надавите на кусочек геля, чтобы рассеять каплю. Далее обратимся к установке для сбора данных, которая состоит из коммерческого флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением.

Оснащен инкубатором и быстрой камерой E-M-C-C-D, подключенной к компьютеру с пакетом приложений, передовым флуоресцентным программным обеспечением и/или программным обеспечением для получения изображений Solis. Поместите образец в держатель на предметный столик микроскопа с помощью двутаврового элемента и проходящего света. Сосредоточьтесь на границе геля.

Затем центрируйте гель над объективом и отрегулируйте фокус, чтобы начать процедуру лазерной юстировки в пакете приложений Leica, передовом флуоресцентном программном обеспечении, выберите автовыравнивание и следуйте процедуре автоматического выравнивания. После того, как лазер будет выровнен в программном обеспечении для сбора данных и или Solis, нажмите кнопку настроек. Откроется окно.

Установите выдержку камеры на 100 миллисекунд, усиление ЭМ на 1000, повторение на 100 и отметьте галочкой перенос кадров. Затем нажмите на окно автосохранения и вставьте название эксперимента. Найдите поле зрения с изолированными одиночными точками.

Сосредоточьтесь на ярком пятне, которое обычно представляет собой агрегат бусин. Затем приобретите 100 кадров. Повторите этот шаг пять-шесть раз, чтобы получить изображения нескольких отдельных пятен.

Импортируйте полученные ряды в программу обработки данных, такую как MATLAB, и усредните стек по времени. Затем отобразите изображение измеренной средней интенсивности. Увеличьте масштаб на ярком маленьком флуоресцентном пятне и примерно определите центр как самый яркий пиксель пятна.

Наконец, выберите размер области интереса, которую вы хотите нарисовать вокруг частицы, обычно на один микрон дальше, чтобы соответствовать выбранному распределению интенсивности с помощью функции Гаусса. Выберите команду gause fit. Осмотрите полученные остатки, чтобы убедиться в хорошей посадке.

Наконец, откалибруйте камеру, как описано в сопроводительном документе. После калибровки системы пришло время пометить ячейки для получения изображений. Начните приготовление липосом, необходимых для инкорпорации липидов, растворив один миллиграмм DOPE, один миллиграмм D-O-T-A-P и один миллиграмм PPE ADO 4 88 в отдельной микроцентрифужной пробирке, содержащей один миллилитр хлороформа.

Далее соедините по 0,5 миллилитров каждого из растворов DOPE и D-O-T-A-P с 25 микролитрами раствора PPE ATO 4 88. Поместите трубку в центробежный испаритель и начните отжим при 280 gs. Запустите вакуумный насос и дайте ему вращаться в течение 24 часов.

На следующий день добавьте в трубку 0,5 миллилитра 20 миллимолярного буфера Heis и закрутите его на 15 минут. Затем поместите трубку в звуковую ванну и обрабатывайте ультразвуком в течение 15 минут при температуре 40 градусов Цельсия. Для приготовления клеток вымойте чашку Р 100 из сливающегося яичника китайского хомяка или CHOK одну клетку трижды с 10 миллилитрами PBS.

Затем добавьте один миллилитр трипсина и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти минут. После инкубации добавьте девять миллилитров D-M-E-M-F 12 с добавлением 10% FBS для суспензии семян 150 микролитров этого раствора, содержащего клетки. В 22-миллиметровом стеклянном дне чашка Петри, содержащая 800 микролитров той же среды.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Для инкорпорации липидов замените клеточную среду 500 микролитрами свободной сыворотки среды и инкубируйте в течение 30 минут. После инкубации добавьте два микролитра раствора липосом и выдерживайте еще 15 минут.

Затем промойте клетки PBS и добавьте новый DM EMF 12. Перед съемкой не менее чем за 12 часов до начала эксперимента включите микроскоп в инкубаторе, чтобы довести предметный столик микроскопа и оптические компоненты до экспериментальной температуры. Самым сложным этапом этой процедуры является то самое приобретение.

Чтобы обеспечить успех, обязательно оптимизируйте каждый параметр сбора данных для системы. Исследуемый. В день эксперимента включите микроскоп, дождитесь, когда камеры достигнут рабочей температуры.

Для проведения эксперимента мы будем использовать две камеры. Первая камера будет использоваться для получения изображений, а вторая — для выбора ячейки. Такая конфигурация обеспечит максимально быстрое и достижимое время сбора данных в программном обеспечении.

Чтобы задать параметры изображения в проходящем свете. Введите 20 миллисекунд В качестве времени экспозиции введите единицу для усиления ЭМ для обеих камер. Затем откройте окно режима контраста в программном обеспечении и выйдите.

Нажмите на BF, чтобы выбрать вариант яркого поля. Поместите образцы в держатель, рассматривая образец через окуляры. Сфокусируйтесь на образце.

Затем вручную направьте свет на первую камеру и осторожно нажмите на щели, чтобы освещалась только область инвестиций, которую нужно изобразить. Далее переместите ячейку в выбранную область и с помощью программного обеспечения направьте свет на вторую камеру. Затем в программном обеспечении нарисуйте ROI для создания ссылки.

Во-первых, для юстировки лазера с помощью программного обеспечения выберите автовыравнивание. Затем, чтобы начать процедуру автоматического выравнивания, выберите «Включить коллиматор». Затем откройте инкубатор сверху и коллимируйте лазерный луч.

Когда лазер будет выровнен в левом нижнем углу окна программного обеспечения слева, нажмите кнопку 70, чтобы установить глубину проникновения на 70 нанометров. Это будет соответствовать углу падения лазера на нижнее стекло около 70 градусов в прикладном пакете Leica. Расширенное флуоресцентное программное обеспечение для текстового поля времени экспозиции.

Введите 70 миллисекунд в текстовое поле EM Gain. Введите 1000, чтобы сделать то же самое на второй камере. Откройте окно настроек и введите те же цифры в соответствующие текстовые поля.

Далее нажмите на кнопку прямого эфира. Флуоресценция будет направлена на первую камеру, и изображение образца появится на экране. Перемещайте образец до тех пор, пока флуоресцентная ячейка не достигнет интересующей эталонной области.

Затем нажмите кнопку на передней части корпуса микроскопа, чтобы направить свет на вторую камеру, и точно переместите колесо положения Z, чтобы сфокусироваться на клеточной мембране в программном обеспечении и или единственном. Откройте окно настроек и установите минимальное время экспозиции, достижимое 1000 EM усиления кропнутого сенсора в режиме 10 до пятого повторения, а также установите опцию автосохранения, чтобы начать получение серии изображений. Нажмите на значок камеры программного обеспечения и дождитесь завершения сбора.

Затем откройте окно настроек, отключите усиление EM и снимите галочку с опции обрезанного режима. Во время съемки температура камеры обычно увеличивается примерно на два-три градуса. Таким образом, прежде чем получать изображения с новой ячейки, дождитесь достижения оптимальной рабочей температуры.

Опять же, после завершения визуализации следуйте инструкциям в сопроводительном документе, чтобы рассчитать среднее квадратичное смещение по результатам визуализации для получения флуоресцентно меченого варианта интересующей молекулы. Клетки CHOK one были либо помечены ADO 4 88 PPE, либо трансфицированы с помощью переноса в рецепторе или T-F-R-G-F-P и визуализированы с помощью TIRF, как описано в этом видео. Как видно на рисунке, измеренный закон диффузии для ADO 4 88 PPE плоский, что указывает на преимущественно свободную диффузию, как ранее было показано с помощью флуоресценции с истощением стимулированной эмиссии, корреляционной спектроскопии или измерений СТС stead после трансфекции с помощью T-F-R-G-F-P, измеренный закон диффузии для T-F-R-G-F-P изначально плоский, оставаясь ниже 100 нанометров среднего молекулярного смещения со средним кажущимся коэффициентом диффузии около 0,7 микрона в квадрате в секунду.

За этим следует быстрое снижение кажущейся диффузии до 0,2 микрона в квадрате в секунду. Величина, обычно измеряемая дифракционно ограниченной FCS. Интересно отметить, что, как показано в последнем примере, настоящий подход может легко измерить среднее молекулярное смещение с разрешением в несколько десятков нанометров даже с использованием относительно тусклых и плотных меток, таких как GFP.

Более того, пространственный масштаб, в котором кажущийся коэффициент диффузии начинает уменьшаться, устанавливает характерный размер частичного удержания белка мембранным скелетом на уровне около 120 нанометров в соответствии с предыдущими оценками. После освоения процедуры анализа данных и их получения можно выполнить за несколько минут. Мы считаем, что этот метод проложит путь исследователям в области клеточной и молекулярной биологии к легкому и количественному исследованию пространственно-временной регуляции диффузии белков и липидов в образцах жизни.