Конформационный Оценка ВИЧ-1 тримерных гликопротеинов с помощью мобильного основе ELISA Пробирной

Общей целью данного эксперимента является исследование гликопротеинов RIC HIV с одной оболочкой или подтверждения ENV с моноклональными антителами. Это достигается путем предварительного пересечения клеток адгезии для экспрессии химерных белков HIV one E NV на поверхности клетки. На втором этапе клетки инкубируются с моноклональными антителами против ENV, которые будут связываться с ENV в зависимости от воздействия эпитопов.

Затем добавляют конъюгированное HRP вторичное антитело для количественной оценки взаимодействия антител с помощью хемилюминесцентного анализа. Получены результаты, которые показывают относительные уровни антител, связанных с ВЗН, на основе относительных световых единиц, полученных для каждого из них. Что ж, основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как связывание, основанное на фактах, заключается в том, что эта техника может быть выполнена с низким количеством антител и при высокой пропускной способности, которую будет выполнять постдок в лаборатории.

Клетки остеосаркомы человека используются в этом эксперименте за сутки до трансфекционной пластины, два раза по 10 до четвертой клетки в лунку. В непрозрачной 96 лунке клеточная культуральная пластина пригодна для считывания люминесценции. Использованная модифицированная среда delcos с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки и пенициллина стрептомицина инкубирует клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе на следующий день.

Приготовьте трансфекционную смесь. Сначала установите две трубы, две секции и две В на две секции. Добавьте пять микролитров DMEM, дополненных 25 миллимолярами хиппи, затем 10 нанограммов тата и покрывающей плазмиды, и 150 нанограммов химерного ВИЧ гликопротеина, кодирующего плазмиду.

Обратите внимание, что TAT-кодирующая плазмида требуется только при использовании TAT-зависимого ВИЧ с одной оболочкой гликопротеина, кодирующего плазмиду до двух B при пяти микролитрах DMM и 450 нанограммах полиэтилена или PEI. Количество реагентов и ДНК должно быть скорректировано в соответствии с количеством лунок, которые должны быть трансфицированы одним и тем же гликопротеином ВИЧ с одной оболочкой. Далее добавьте содержимое двух Б в два отсека и тщательно перемешайте, вортексируя в течение 10 секунд.

Инкубируйте трансфекционную смесь в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут добавьте 10 микролитров смеси для трансфекции в лунку 96-луночного планшета и инкубируйте в течение 48 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% оксида углерода. В Ali SA для изучения распознавания химерного гликопротеина ВИЧ с одной оболочкой моноклональными антителами проводят через два дня после трансфекции клеток остеосаркомы человека.

Приготовьте 250 миллилитров промывочного буфера на одну одновременно используемую пластину. Приготовьте 125 миллилитров блокирующего буфера на тарелку, добавив 1% обезжиренного сухого молока и пять миллимоляров триса pH 8,0 в буфер для стирки. Удалите питательную среду для клеточных клеток и трансфекционную смесь из 96-луночного планшета.

Добавьте 100 микролитров блокирующего буфера на лунку и выдерживайте 20 минут. При комнатной температуре удалить надосадочную жидкость и добавить 50 микролитров антител на каждую разведенную до соответствующей концентрации в блокирующий буфер. Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре.

Вымойте три раза со 100 микролитрами блокирующего буфера, а затем повторите процесс стирки три раза. Постирайте три раза со 100 микролитрами блокирующего буфера, а затем трижды постирайте со 100 микролитрами буфера для стирки после последней стирки. Снимите осадок.

Добавьте 100 микролитров блокирующего буфера и выдерживайте в течение пяти минут. При комнатной температуре удалите надосадочную жидкость и добавьте 50 микролитров вторичного антитела, разведенного один к 3000 в блокирующий буфер. Выдерживать в течение 40 минут при комнатной температуре через 40 минут.

Постирайте три раза со 100 микролитрами блокирующего буфера, затем три стирки со 100 микролитрами буфера для стирки. Чтобы подготовить образцы к сбору данных, удалите надосадочную жидкость из 96-луночного планшета и добавьте 30 микролитров одного усиленного хемилюминесцентного субстрата на лунку. Получите сигнал хемилюминесценции в течение одной секунды на лунку на подходящем планшетном ридоре.

Согласно инструкции производителя, воздействие растворимого CD 4 или S CD 4 на экспозицию эпитопов CD 4 I на гликопротеины оболочки или ENV было в анализе: взаимодействие CD 4 с ENV индуцирует подтверждающие изменения ENV, которые обнажают 17 B и 48 D эпитопы, перекрывающие сайт связывания ко-рецептора, но не влияют на внешний домен, распознающий антитело 2 G 12. Для оценки влияния точечных мутаций на подтверждение NV использовали два мутанта ENV: H 66 A, который имеет меньшую склонность к спонтанной выборке подтверждения CD 4, и S3 75 W, который предрасполагает NV к CD 4 связанному состоянию. Нормализация исходных данных в соответствии с уровнями экспрессии показывает, что H 66 A уменьшает распознавание CD 4 I 17 B, в то время как S3 75 W усиливает сигнал 17 B и достаточен для восстановления фенотипа H 66.

Мутантный анализ клеток колеблется с увеличением количества экспрессора CD 4. Вместе с NV синими полосами выявлены усиливающиеся сигналы для моноклональных антител CD 4 I, A 3, 2 и C 11, которые распознают прерывистые эпитопы во внутреннем домене гликопротеина ENV. Распознавание GP one 20 ENV двумя антителами G 12 не было затронуто.

Наконец, исходные данные были нормализованы до двух G 12, отсутствие модуляции 32 и C 11 при трансфекции ENV с мутантом CD 4 с пониженной способностью взаимодействовать с ENV указывает на то, что повышенное количество сигналов зависело от взаимодействия E NV CD 4. После освоения этот метод может быть выполнен за четыре часа.