Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований: Экс-ово Электропорация подход

Общая цель этой процедуры заключается в достижении высокой эффективности плазмидной трансфекции клеток сетчатки для проведения функциональных генетических исследований в первичных культурах сетчатки. Это достигается путем первого сбора куриных эмбрионов на стадии 27 системы гамбургера и Гамильтона. Правильная постановка имеет решающее значение для достижения оптимальной эффективности.

Вторым шагом является вскрытие эмбриональных глаз и удаление пигментного эпителия сетчатки, обнажающего нервную сетчатку. Далее чашечка сетчатки помещается в камеру, заполненную плазмидным раствором. Затем он подвергается электропорации в оптимизированных условиях с использованием легко конструируемых электродов по индивидуальному заказу.

Заключительными этапами являются удаление стекловидного тела и хрусталика и диссоциация нервной сетчатки на отдельные клетки для первичной культуры низкой плотности. В конечном счете, трансфицированные клетки могут быть визуализированы с помощью экспрессии репортерных генов или иммуногистохимии, а эффективность генетических манипуляций может быть оценена путем оценки экспрессии нижестоящих генов и/или фенотипических изменений клеток. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как липофектия или химическая трансфекция, заключается в том, что она увеличивает скорость трансфекции клеток сетчатки в пять раз, что дает эффективность от 22 до 25% от общей популяции клеток.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии фоторецепторов, поскольку он позволяет манипулировать экспрессией генов в первичных культурах сетчатки на уровне эффективности, который может обеспечить биологически значимые выводы. Последствия этого метода выходят за рамки фундаментальных исследований, поскольку они могут быть легко адаптированы к высокопроизводительным технологиям для разработки лекарств. Начните с инкубации оплодотворенных яиц курицы с белой ногой при температуре 37,5 градусов Цельсия и относительной влажности 60% в течение пяти дней в инкубаторе для яиц.

Перед экспериментом приобретите коробчатую нить, обычно используемую в микропипетках. С помощью щипцов расстегните квадратную коробку и расправьте нить в длинную полосу. Затем, используя линейку в качестве руководства, согните нить в квадратную U-образную форму, длиной три миллиметра у основания и высотой два миллиметра с одной стороны с другой стороны, оставшуюся длину нити используйте щипцами, чтобы окунуть электрод в 96% этанол и кратковременно обжечь электрод, чтобы стерилизовать его.

Затем прикрепите электрический провод с помощью небольшого зажима типа «крокодил» к длинному плечу электрода. Затем протрите толстый электрод с золотым наконечником, используя 70% этанола. Затем подготовьте камеру электропорации, срезав крышку стерильной микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 миллилитра с помощью стерилизованных ножниц и прикрепив ее плоской стороной вниз к 100-миллиметровой чашке Петри с помощью ленты.

Затем простерилизуйте инструменты для микрозащиты, окунув наконечники инструментов в 96% этанол и кратковременно обжарив их. Кроме того, протрите область для вскрытия, используя 70% этанол. Подогрейте бутылку стерильного раствора соли Hanks Balance без кальция и магния на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда температура нагреется, заполните 100-миллиметровую стерильную чашку Петри на три четверти. Далее поместите камеру электропорации под чистый диссекционный микроскоп. Затем подключите электроды к аппарату электропорации, убедившись, что изготовленный на заказ электрод подключен к отрицательному полюсу, а электрод с золотым наконечником подключен к положительному полюсу машины.

Очистите яйца, протерев внешнюю поверхность скорлупы 70% этанолом. Будьте осторожны и поддерживайте стерильность на протяжении всей остальной части протокола. Чтобы избежать попадания загрязнения в культуры, с помощью больших изогнутых щипцов Мэлони осторожно откройте отверстие в яичной скорлупе, осторожно постукивая по закругленному кончику яйца непосредственно над воздушной камерой.

Вытащите все части скорлупы с помощью еще одной пары щипцов. Удалите оболочки и соберите эмбрион, осторожно вычерпав его из яйца. Поместите эмбрион в чашку Петри с предварительно подогретым раствором соли Hanks Balance без кальция и магния.

Когда будет собрано соответствующее количество эмбрионов, убедитесь, что все они находятся на правильной стадии. Согласно системе стадирования по Гамбургеру и Гамильтону, для оптимальной эффективности эмбрионы должны находиться на стадии 27. Усыпьте эмбрионы путем обезглавливания с помощью щипцов Мэлони, а затем используйте пинцет Дюмона, чтобы осторожно и зародышеть глаз.

Переложите глаза в новую чашку Петри с HBSS, не содержащим кальция и магния. Начните с задней части каждого глаза, близкой к диску зрительного нерва, а затем введите по одному кончику каждой пары пинцета Дюмона между нервной сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки. Двигаясь от задней части глаза к передней, с помощью пинцета тщательно рассеките пигментированный эпителий сетчатки.

Будьте осторожны, чтобы не повредить нервную сетчатку. Настройте электропертер так, чтобы он подавал пять квадратных импульсов по 15 вольт с длительностью 50 миллисекунд и интервалом 950 миллисекунд. Далее заполните камеру электропорации 120 микролитрами раствора плазмиды в концентрации 1,5 микрограмма на микролитр в PBS.

Затем поместите U-образный отрицательный электрод в камеру электропорации крышки микроцентрифуги. С помощью изогнутого пинцета Дюмона. Перенесите одну чашечку сетчатки в камеру электропорации и поместите ее внутрь U-образного электрода.

Расположите сетчатку так, чтобы ее задняя часть находилась ближе к нижней части электрода, а хрусталик был обращен вверх. Далее расположите анод так, чтобы он касался передней части глаза рядом с линзой. Затем используйте ножную педаль электрорейдера, чтобы подать пять электрических импульсов.

Когда закончите, перенесите электропорированную чашку сетчатки в новую чашку Петри, наполненную HBSS, не содержащим кальция и магния. Повторяйте процедуру электропорации с каждой дополнительной чашечкой сетчатки. До шести чашек сетчатки могут быть электропорированы одним и тем же раствором плазмиды без существенного снижения эффективности трансфекции.

Затем с помощью зубчатых щипцов аккуратно удалите хрусталик и стекловидное тело из каждого электропорированного образца, удерживая глаз на месте тыльной стороной изогнутого пинцета Дюмона, после снятия приступайте к диссоциации и культивированию электропорированных клеток сетчатки с использованием стандартных методов. Показанные здесь клетки сетчатки были подвергнуты электропорации с экспрессией GFP, плазмиде, диссоциированы и культивированы в течение четырех дней. Флуоресцентные микрофотографии показали пятнистые окрашенные ядра и GFP, экспрессирующие клетки сетчатки.

Окрашивание антивизиновыми антителами проводилось для идентификации фоторецепторных клеток. Параметры, описанные в этом протоколе, были оптимизированы для получения эффективности трансфекта, которая в среднем составляет 22% по сравнению с общей популяцией через четыре дня. В культуре этот показатель увеличивается в среднем до 25%, когда только популяция фоторецепторов считается рассматриваемой после освоения.

Эта техника от сбора эмбрионов до электрооперации может быть выполнена менее чем за 30 минут для шести глаз, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что между сбором эмбрионов и осаждением диссоциированных клеток должно пройти не более трех часов, чтобы получить культуру хорошего качества. Этот метод может быть применен для сверхэкспрессии или корреляции генов, например, с помощью системы РНК-интерференции.

Кроме того, сетчатка, которая была трансфицирована после этой процедуры, может быть использована для органотипических культур сетчатки.