Измерение Местные Анафилаксия у мышей

Общая цель этой процедуры заключается в измерении изменений проницаемости сосудов, количественной оценке локализованных аллергических реакций. Это достигается путем предварительной сенсибилизации животных к аллергену, такому как О-альбумин. Второй шаг – это воздействие на уши с помощью внутрикожной инъекции аллергена.

Затем в хвостовую вену вводится синий краситель Эвана. Последним шагом является извлечение красителя из проблемных ушей путем их инкубации в течение ночи. В форме, амид, в конечном счете, спектральная фотометрия используется для количественной оценки количества красителя, попавшего в ухо.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что экстравазация красителя измеряется методом спектрометрии. Это означает, что анализ не так легко подвержен предвзятости наблюдателя. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что внутрикожные инъекции и инъекции в хвостовую вену технически сложны и требуют большой практики для достижения мастерства.

Начните с доведения щелочного раствора до комнатной температуры для использования. При комнатной температуре разбавьте яйцеклетку до концентрации один миллиграмм на миллилитр в одной XPBS. Используйте пятимиллилитровую полистирольную трубку с круглым дном.

Сделайте трубку вихревой на средних оборотах, и аккуратно добавьте равный объем тщательно гомогенизированного. Вводите квасцы в раствор яйцеклетки по каплям. Параллельно приготовьте отрицательный контрольный раствор квасцов, смешанных с PBS в соотношении один к одному, используя ту же методику.

Затем закройте трубки крышками и закрепите их на вихре. Запустите вихрь на самом низком уровне в течение получаса с прикрепленными трубками. Когда растворы будут готовы, немедленно приступайте к сенсибилизации мышей BAB.

Загрузите смесь квасцов для яйцеклеток в одномиллилитровый шприц. Затем с помощью иглы 27 калибра введите по 100 микролитров в брюшину каждой мыши. Повторите то же самое для мышей отрицательного контроля, использующих раствор квасцов без яйцеклеток, в течение следующих трех недель.

Повторите этот процесс в общей сложности три инъекции на мышь после последней инъекции, подождите не менее двух недель, прежде чем выполнять анализ местной анафилаксии из замороженных яйцеклеток. Начните с приготовления рабочего раствора пять миллиграммов на миллилитр в PBS. Кратковременно перебейте его в вихрь, используя фтор 5% ISO.

Обезболите сенсибилизированную мышь, и когда она станет неподвижной, уменьшите изофтор до 3%. Теперь загрузите в шприц с тремя 10 инсулиновыми инсулинами 10 микролитров препарата для яйцеклеток, заколите его иглой 31 калибра и загрузите во второй шприц 10 микролитров одного XPBS. Далее оберните 15 миллилитровую коническую трубку прозрачной липкой стороной наружу под препарирующий микроскоп, закрепите тыльную сторону левого уха мыши, находящейся под наркозом, к трубке. Вставьте иглу шприца PBS скошенной стороной вверх между двумя створками уха и медленно введите полные 10 микролитров.

Избегайте попадания на кровеносные сосуды. Успешная инъекция приведет к явному внутрикожному всплеску. Очень важно ввести в ухо весь объем.

Если какая-либо жидкость вытекает из места инъекции, животное не может быть использовано в анализе. Кроме того, если игла полностью проходит через ухо или царапает поверхность уха, анализ недействителен, потому что эти травмы могут исказить результаты в правом ухе. Используйте тот же метод для введения яйцеклетки в течение трехминутного периода.

Переложите мышь в ограничитель и поместите ее под тепловую лампу. Затем медленно введите в хвостовую вену 200 микролитров 0,5% синего красителя Эванса. При использовании иглы 27 калибра быстрая инъекция может нанести вред, если сосуд будет разрушен до того, как будет введен весь краситель.

Продолжайте впрыскивание на противоположную сторону хвоста. Теперь подождите 10 минут, а затем усыпьте мышь углекислым газом с последующим вывихом шейки матки. После того, как животное будет усыплено, используйте щипцы и ножницы, чтобы удалить уши.

Захватите край уха щипцами, не оказывая давления на место инъекции. Затем разрежьте вплотную, но не через хрящевой гребень у основания ушей. Соберите как можно больше ткани.

Теперь, принимая надлежащие меры предосторожности, выложите по 700 микролитров амида формы для каждого уха в микроцентрифужную пробирку. Перенесите по уху в каждую трубку и инкубируйте их в течение ночи при температуре 63 градуса Цельсия в блоке сухого тепла, на следующий день большая часть красителя будет извлечена, но уши могут казаться слегка синими. Добавьте по 300 микролитров каждого образца в 96-луночный планшет.

Избегайте переноса меха и не образуйте пузырей для заготовок. Загрузите в две лунки 300 микролитров формы амида. Затем измерьте поглощение на 620 нанометрах.

Вычтите значения из фона и проанализируйте результаты. Животные, сенсибилизированные к PBS, не реагировали на провокацию яйцеклеток или PBS. Как и ожидалось, оба уха остались белыми.

В течение года, когда их проводили провокационную провокацию PBS у сенсибилизированных к OVA животных, они были либо полностью белыми, либо светло-голубыми, локализованными в месте инъекции, где их уши, получающие провокационную провокацию от яйцеклеток, становились все темнее в течение 10 минут после введения красителя, обработанная IDE ушная ткань сенсибилизированных PBS животных имела незначительные показатели абсорбции после как PBS, так и OVA. В то время как для животных, сенсибилизированных яйцеклетками, инъекция PBS обычно приводила к среднему показателю абсорбции 0,13. И наоборот, провокация яйцеклеток 50 микрограммов привела к среднему показателю поглощения 0,58.

Количество яйцеклеток, используемых для челленджа, можно регулировать в определенных пределах. Например, воздействие на 20 микрограммов привело к среднему поглощению 0,30. Тем не менее, испытание менее 20 микрограммов не дало надежных результатов.

Несмотря на то, что это сложная задача, когда человек овладевает внутрикожными и внутривенными инъекциями, эта техника может быть выполнена на одном животном примерно за 15 минут. Процедура может быть выполнена на 10 животных примерно за час. Этот анализ очень универсален, поскольку его можно использовать как при активной, так и при пассивной кожной анафилаксии.

Его также можно использовать для лечения самых разных аллергенов. Не стоит забывать и о том, что изоф фтора может оказывать негативное воздействие на репродуктивную систему человека. Используйте его только в хорошо проветриваемом помещении и прикрепите к индукционной камере канистру для сбора мусора, чтобы нейтрализовать отходящие газы, если вы беременны.

При использовании изофтора носите маску с угольным фильтром, чтобы свести к минимуму воздействие.