Эффективное плюрипотентных клеток поколения от крови Использование эписом и HDAC ингибиторов

Общая цель данного эксперимента заключается в получении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток без интеграции из небольшого количества периферической крови. Это достигается путем культивирования изолированных мононуклеарных клеток периферической крови в определенных факторах роста с получением популяции эритроцитов-предшественников, которая очень чувствительна к перепрограммированию. В качестве второго шага неинтегрирующиеся эписомальные плазмиды, несущие перепрограммирующие гены, вводятся в эритробласты путем поражения ядер, чтобы инициировать процесс перепрограммирования.

Затем пораженные ядром клетки наносятся на слой облученных эмбриональных фибробластов мыши, чтобы обеспечить дальнейшее перепрограммирование в конечном итоге успешно. Перепрограммированные колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток могут быть идентифицированы на основе их морфологических характеристик, активности щелочной фосфатазы, положительной иммунохимии маркеров плюрипотентности и экспрессии эндогенных генов плюрипотентности. Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как вирусное перепрограммирование, заключается в том, что этот протокол обеспечивает последовательную генерацию IPSC без интеграции.

Лаборант в лаборатории Начните с разбавления периферической крови в соотношении один к одному в DPBS. Затем в 15-миллилитровую полистирольную трубку с круглым дном аккуратно налейте семь миллилитров разведенной крови на три миллилитра комнатной температуры. После отделения образца в течение 30 минут при 400 GS и комнатной температуре, pbmc осядет в мутном белом слое границы раздела между плазмой и флаконом.

С помощью стерильной переводной пипетки перенесите P BMC в коническую трубку объемом 15 миллилитров и доведите объем до 10 миллилитров с помощью свежих DPBS. Затем, после подсчета клеток, перенесите два раза по 10 к шести P BMC в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров и раскрутите оставшиеся клетки, заморозьте гранулированные клетки в концентрации от двух до 10 до 6 pbmc на миллилитр в 90% фетальной бычьей сыворотке с 10% диметилсульфоксидом. Затем, после раскрутки отложенных P-BMC, мы суспензируем гранулы в двух миллилитрах свежеприготовленной расширительной среды и помещаем их в одну лунку 12-луночного планшета для культуры тканей, инкубируем клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с атмосферой 5% кислорода, 5% углекислого газа и 90% азота.

Затем на третий и шестой день замените среду, собрав клетки из лунки. Промывка лунки двумя миллилитрами QBSF 60 для сбора любых оставшихся клеток, гранулирование клеток методом центрифугирования, а затем ресуспензия гранулы в двух миллилитрах свежей расширяющей среды. Затем верните клетки в ту же 12-луночную пластину и продолжайте инкубацию На девятый день пипеткой перепрограммируйте плазмиды в стерильную пробирку эйнора объемом 1,5 миллилитров, как указано в таблице.

Далее смешайте раствор нуклеотидного поражения с добавками, поставляемыми производителем, и переложите смесь в стерильную пробирку DPH объемом 1,5 миллилитров. Затем выдайте два миллилитра расширительной среды в одну лунку нового 12-луночного планшета и уравновесьте среду во увлажненном 37 градусах Цельсия инкубаторе до тех пор, пока ячейки не будут готовы. Соберите клетки, хорошо промойте клеточную культуру, как только что продемонстрировали и промойте клетки в пяти миллилитрах DPBS.

Затем восстановите, суспензируйте клеточную гранулу в 100 микролитрах раствора Nucle и добавьте добавку, стараясь избежать образования пузырьков, и перенесите клеточную суспензию в пробирку, содержащую перепрограммированную плазмиду. Смешайте клетки, пипетируя вверх и вниз по одному разу, и перенесите весь раствор на дно поражения ядра. Затем поместите вету в аппарат Nucle и запустите программу T 0 1 9.

Теперь добавьте 100 микролитров УРАВНОВЕШЕННОЙ расширительной среды в тест для поражения ядер и немедленно соберите весь образец, избегая белых плавающих остатков мертвых клеток, и поместите его в лунку предварительно теплой среды. Затем поместите клетки обратно во увлажненный инкубатор на 10 или 11 день. Смажьте каждую лунку шестилуночного тканевого планшета желатином с одним миллилитром 0,1%-ного желатина в HBSS, а затем поместите планшет во увлажненный инкубатор или не менее чем за пять минут во время инкубации переведите один флакон оттаивания, два раза по 10 раз по 10 градусов в шесть облученных по 3000 градусов Цельсия мышей, эмбрионов, фибробластов или МЗ в 10 миллилитров предварительно подогретых метамфетаминовых сред, А затем центрифугируйте клетки, пока они вращаются.

Отсадите желатиновый раствор из шестилуночной пластины, а затем повторно суспендируйте mes в 12 миллилитрах свежей метамфетаминовой среды. Немедленно выдайте по два миллилитра ОФМ в каждую лунку, покрытую желатиновой оболочкой. Шесть. Хорошо выложите тарелку и поместите тарелку обратно в увлажненный инкубатор до 12 дня.

На 12-й день соберите пораженные ядром клетки из лунки в одну коническую трубку объемом 15 миллилитров, промыв лунку для сбора оставшихся клеток. После раскрутки ячеек мы суспендируем гранулу в 12 миллилитрах свежеприготовленной перепрограммируемой среды и дозируем по два миллилитра клеток в каждую лунку питающих ячеек. В шестилуночном планшете затем центрифугируйте планшет в течение 30 минут при 75 GS и комнатной температуре, а затем поместите планшет обратно в увлажненный инкубатор, меняя среду через день в течение одной-двух недель.

Как только появятся индуцируемые плюрипотентные колонии клеток, начните скармливать клеткам свежеприготовленную среду эмбриональных стволовых клеток человека, содержащую ингибиторы гистондеацетилазы, через три дня после поражения ядра и перед нанесением пораженных ядром клеток на индуцируемый метамфетамин. Эффективность успешного ядерного поражения NU должна быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии Для EGFP, например, показан типичный эксперимент по поражению ядер, в котором примерно от 5 до 10% от общей популяции клеток, экспрессирующих EGFP, перепрограммированные индуцируемые плюрипотентные колонии стволовых клеток начнут появляться примерно через две недели после ядерного поражения NU. Колонии, как правило, круглые с четко определенными границами и могут быть идентифицированы по характерной для них морфологии эмбриональных стволовых клеток человека, включая небольшие плотно упакованные клетки с высоким соотношением ядер и цитоплазмы и видимыми ядрышками репрезентативных линий, которые были полностью охарактеризованы.

Все тесты с положительным результатом на активность щелочной фосфатазы экспрессируют стандартные маркеры плюрипотентности и реактивируют эндогенные гены плюрипотентности после освоения. Этот метод может стабильно генерировать IPSC без интеграции за четыре недели, если он выполнен правильно. После этой процедуры могут быть проведены дифференцировочные исследования, чтобы ответить на вопросы о любом типе ткани.