Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

Общая цель этой процедуры заключается в получении высококачественных культур кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток и соответствующей характеристике конечного продукта с помощью проточной цитометрии. Для этого создаются высококачественные монослойные культуры недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток. Затем кардиомиогенез индуцируется путем модуляции пути ветра с помощью малых молекул.

Затем кардиомиоциты фиксируются, проникают и окрашиваются с использованием условий, специально оптимизированных для каждого антитела. Наконец, клетки анализируются с помощью проточной цитометрии. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые демонстрируют культуры, которые высоко позитивны в отношении сердечных маркеров, TNNI 3 и IRX 4, а также демонстрируют желудочковые потенциалы действия.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как в корпусах сотрудников и плетеных телах, заключается в том, что он относительно прост в реализации и экономически эффективен. Кроме того, метод генерирует культуры клеток, которые обладают высокой положительностью в отношении сердечного тропонина I. Без внутренней базовой изменчивости и эффективности, наблюдаемых другими протоколами, визуальная демонстрация метода имеет решающее значение, поскольку качество клеток предварительной дифференцировки значительно влияет на эффективность дифференцировки. Также неправильная фиксация и проницаемость до окрашивания антителами приведут к неоптимальным результатам проточной цитометрии, демонстрируя проведение процедуры Шабо Бачар, аспирант из моей лаборатории.

Наиболее сложным аспектом данной процедуры является поддержание высокого качества недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток до дифференцировки. Использование клеток с неоптимальными характеристиками роста существенно повлияет на эффективность дифференцировки. Начните эту процедуру с хорошо зарекомендовавших себя высокопроизводительных вычислительных систем, выращенных в шести чашках, покрытых матричным покрытием, сертифицированных HESC.

Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они демонстрируют однородную морфологию. Если клетки демонстрируют морфологию, подобную нейральным эпителиям или фибробластам, как показано здесь, их не следует использовать. Обеспечьте устойчивую пролиферацию клеток при посадке со скоростью 0,75 млн на лунку, проходите их примерно каждые три дня при 75%-ном прохождении клеток с диссоциацией до уровня одной клетки, по крайней мере, пять раз до начала дифференцировки к пассиону.

Клетки сначала отсасывают питательную среду E eight и дважды промывают клетки четырьмя миллилитрами PBS, предварительно подогретыми до комнатной температуры. Затем добавьте по одному миллилитру раствора для отделения клеток комнатной температуры в каждую лунку и оставьте лунку нетронутой до тех пор, пока границы клеток не начнут округляться. Обычно это занимает от трех до семи минут, и это можно наблюдать макроскопически и подтвердить с помощью микроскопа.

Далее с помощью ватной стеклянной пипетки с колбой выбивают клетки и переносят их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую один миллилитр среды DM EMF 12. Это приведет к инактивации раствора для отслойки клеток. Удалите 10 микролитров аликвоты клеточного раствора и смешайте его с 10 микролитрами трианового синего в микроцентрифужной пробирке.

Подсчитайте ячейки и затем соберите их центрифугой, 15 миллилитровой конической трубкой при 130 GS в течение пяти минут. При комнатной температуре во время центрифугирования подсчитывают клетки с помощью автоматизированного гемоцитометра. Ожидайте от 70 до 80% жизнеспособности в будущем.

Основывайте все номера ячеек на общем количестве ячеек, а не на жизнеспособном количестве клеток. После спина отсасывают среду и ресуспендируют клеточную гранулу в D-M-E-M-F 12 до конечной концентрации 0,75 умножить на 10 на шесть клеток на 500 микролитров, добавьте 0,5 миллилитра клеточной суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета, в котором каждая лунка содержит два миллилитра среды E eight. С помощью ингибитора горных пород осторожно покачивайте пластину спереди назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить ячейки по лунке.

Верните клетки в инкубатор с содержанием углекислого газа 5% и температурой 37 градусов Цельсия. Через 24 часа после упаковки. Начните ежедневную замену среды, используя два миллилитра на лунку Е восьми без ингибитора горных пород.

Оптимизируйте плотность посева для достижения 100% слияния до начала дифференциации. В нулевой день клетки на 100% сливаются друг с другом с компактной морфологией и минимальным количеством клеточного мусора. Начните процесс дифференцировки с замены среды Е восемь на два миллилитра дифференцировки. Терпимая.

Во-первых, добавьте в каждый по 1,2 микролитра CHIR. В первый и второй дни обычно наблюдается значительная гибель клеток на 40-50%. Тем не менее, прикрепленные клетки сохранят компактную морфологию.

За это время среда становится оранжевой и мутной. Если наблюдается розовая среда, которая указывает на чрезмерную гибель клеток, подтвердите жизнеспособность клеток триамным синим цветом и прекратите, если гибель клеток превышает 70%. В противном случае в первый день повторите процесс замены среды двумя миллилитрами свежей дифференцировки. Терпимая. Во-первых, добавьте по 1,2 микролитра CHIR в каждую лунку и на второй-третий день замените на свежую среду для дифференцировки.

Во-первых, в течение третьего и четвертого дней клетки будут восстанавливаться, а на четвертый день их плотность увеличится. Замените среду в каждой лунке свежей дифференцировкой. Средний номер один и один микролитр IWR один.

В течение пятого-шестого дней происходит минимальная гибель клеток, а на пятый день могут начать появляться плотные пятна, заменяющие среду свежей дифференцировкой. Используйте среду номер один, и добавьте по одному микролитру IWR в каждую лунку на день с шестого по седьмой, замените среду на свежую дифференцировку. Средний номер один.

К седьмому-восьмому дню достигается сливающийся монослой с компактной морфологией, перемежающейся плотными пятнами. К восьмому дню клетки начнут спонтанно сокращаться, и первые сокращения часто будут видны в плотных пятнах. На восьмой день замените среду свежей дифференцировкой. Терпимая.

Номер два, продолжайте заменять дифференцировочной средой номер два, через день на время культивирования. К 10-му дню наблюдается более сильное сокращение, которое будет продолжать распространяться по всей культуре в последующие дни. В этом видео показаны клетки на 30-й день, а здесь клетки показаны на 55-й день.

Чтобы собрать клетки для проточной цитометрии, выполните сбор и подсчет диссоциации клеток, как и ранее. Обратите внимание, что на этом этапе клетки не нужно содержать стерильными. Осторожно вортексируя клеточную гранулу, добавьте 100 микролитров фиксирующего раствора в клеточную гранулу по каплям.

Затем инкубируйте трубку на льду в течение 15 минут. Добавьте три миллилитра раствора для промывки клеток, соберите клетки центрифугированием после отжима, отаскуйте раствор во время вортексирования. Добавьте 100 микролитров проницаемого раствора в клеточную гранулу по каплям, как и раньше.

Затем инкубируйте трубку на льду в течение 30 минут. Добавьте три миллилитра раствора для мытья клеток. Соберите клетки центрифугированием и отаскайте раствор.

Повторите в общей сложности два промывки после проникновения. Проводите окрашивание антител, как описано в сопроводительном документе, с помощью пипетки P 1000 в 400 микролитрах раствора для поддержания клеток и дезагрегируйте их путем пипетирования вверх и вниз. Затем предварительно намочите крышку клеточного фильтра на круглой нижней пробирке 50 микролитрами раствора для поддержания клеток.

Установите трубку на лед. Крышка клеточного фильтра предотвращает засорение проточного цитометра клеточными агрегатами. Затем перелейте раствор ячейки на крышку сетчатого фильтра и дайте суспензии клеток стечь под действием силы тяжести.

Осторожно постучите по дну трубки по столешнице, чтобы клетки собрались в трубку. Как можно быстрее положите трубку обратно на лед. Промойте ситечко 250 микролитрами раствора для поддержания клеток, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток.

Поддерживайте клетки на льду и защищайте их от света до тех пор, пока они не будут проанализированы с помощью проточной цитометрии для определения качества генерируемых кардиомиоцитов. Используя этот протокол, клетки дифференцировали в течение 10 дней и окрашивали антителами против TNNI 3 a, пан кардиомиоцитарного маркера, TNNT 2 a поперечнополосатого мышечного маркера и маркера IRX четырех желудочковых кардиомиоцитов. Обратите внимание, что условия фиксации и проницаемости были оптимизированы для каждого антитела для достижения максимального процента положительных клеток.

Гистограммы показывают, что 99% закрытых клеток были положительными на TNNI 3 и 96% были положительными на IRX 4. Кроме того, клетки были высоко положительны к другим маркерам сердечной дифференцировки, включая TNNT 2, MLC 2 V и MLC 2. Обратите внимание, что утверждение о чистоте кардиомиоцитов и идентичности клеток основано на TNNI 3 и IRX 4.

Окрашивание MC 2 V и MC 2 A не ограничиваются камерой во время развития, а TNNT 2 также обнаруживается в скелетных мышцах. Показанный здесь потенциал действия был зарегистрирован у одного спонтанно сокращающегося кардиомиоцита на 46-й день дифференцировки с использованием зажима целого клеточного пластыря. Профиль потенциала действия указывает на то, что были получены желудочковые кардиомиоциты.

Также наблюдался небольшой процент узловых профилей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как получить высококачественные культуры кардиомиоцитов из плюрипотентных стволовых клеток и как охарактеризовать их с помощью проточной цитометрии. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за общих проблем, возникающих при поддержании стволовых клеток в качестве высококачественных монослоев до начала дифференцировки.

Не стоит забывать, что работа с фиксатором может быть опасной и личной. Во время выполнения этой процедуры всегда следует надевать защитные средства, такие как лабораторный халат или перчатки.