Создание Анатомически точного и воспроизводимого внутричерепного Ксенотрансплантаты человека опухолей головного мозга

Общая цель этой процедуры заключается в создании согласованной и воспроизводимой модели опухоли головного мозга человека, которая может быть использована для точного тестирования и сравнения новых терапевтических стратегий. Это достигается путем подготовки животного к операции и определения правильного места для инъекции. После его обнаружения в черепе просверливается отверстие и на нужную глубину опускается шприц

Чтобы добиться роста опухоли, клетки затем медленно вводят контролируемым образом, после чего следует отсроченное и постепенное извлечение иглы. В конечном счете, может быть разработана последовательная мышиная модель с гистопатологически сходным с человеческим состоянием роста и измерены темпы роста с помощью Lucci на основе визуализации in vivo. Точность этой техники жизненно важна для понимания новых терапевтических стратегий для опухолей головного мозга человека.

Вариабельная локализация инъекции опухоли может привести к изменениям в росте опухоли, которые обусловлены микроокружением, доставкой лекарств или другими факторами, которые сильно различаются в разных областях мозга. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что шаги, связанные с позиционированием мыши и локализацией места инъекции, требуют трехмерных манипуляций, которые нелегко описать в письменном или графическом формате. Для начала очистите и обеззаратьте мышь стереотаксической рамкой и всем остальным оборудованием, необходимым для проведения операции.

Использование оптимизированных для модели выбранной программы настроек, параметров впрыска и других переменных для работы шприцевого насоса. Далее расположите автоклавные хирургические инструменты в рабочей зоне, включают в себя не менее двух стоматологических бормашин диаметром 1,0 миллиметра для серийных процедур. Продезинфицируйте хирургические инструменты 70% этанолом, а затем в течение 30 секунд в стерилизаторе для бусин между каждым животным или в соответствии с вашими протоколами IACUC.

Наконец, соберите все необходимые медицинские принадлежности и одноразовые материалы Тонкий наконечник, перманентный маркер для маркировки черепа должен быть обеззаражен и предназначен для хирургического использования. После трипсина резус суспензируют клетки в PBS и гранулируют центрифугированием Резус. Суспендируйте клетки примерно в пяти миллилитрах свободной сыворотки dmem на 100-миллиметровую пластину.

Затем подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемо, цитометра или автоматического счетчика клеток. После подсчета отрегулируйте плотность живых клеток, гранулируя клетки и суспензируя SF dmm. Храните клетки в охлажденном состоянии на льду или охлаждающем пакете, но не допускайте их замерзания.

Осторожно перемешайте, взмахнув пальцами, нанесите животному обезболивающее средство и убедитесь, что животное адекватно усыплено, проверив на пишущий рефлекс или отсутствие активности. После обезболивания накройте мышь марлевыми салфетками для тепла и регулярно следите за животным на протяжении всей процедуры. Далее расположите мышь в стереотаксической рамке.

Используя поддон и ушные планки, старайтесь, чтобы поверхность уха к глазу была как можно более горизонтальной. Наконец, смажьте глаза офтальмологической мазью и дважды очистите кожу между ушами и глазами, чередуя нанесение повидон-йода, антисептика и 70% этанола. После подкожного введения обезболивающего средства подтвердите, что животное полностью обезболито, проверив рефлекс защемления пальца ноги.

Непосредственно перед разрезом кожи сделайте небольшой разрез, чтобы обнажить БМА и место инъекции. Диагональный разрез от точки между осью средней линии и правым глазом к правому уху позволяет провести ось как к bgma, так и к месту инъекции. Втяните кожу и с помощью стерильного ватного тампона высушите поверхность черепа.

Промокните косточку другим тампоном, смоченным перекисью водорода. Чтобы визуализировать bgma, зафиксируйте пустой шприц с иглой в микропомпе и переместите наконечник прямо над bgma. Обнулите координаты на консоли выравнивания.

Переместите иглу на 2,5 миллиметра в сторону и на 1,5 миллиметра вперед с уважением. Торема. С помощью ручек управления на стереотаксическом блоке слегка приподнимите шприц и отметьте точное местоположение на черепе специальным наконечником из войлока. Ручка. Если наружная поверхность черепа больше не находится на уровне bgma в дорсальной плоскости, сбросьте дорсальные вентральные показания до нуля, чтобы убедиться в правильности глубины инъекции.

Просверлите небольшое отверстие в черепе с помощью ручной вращающейся дрели, оснащенной стерильным наконечником для зубов. Держите сверло под углом к черепу и очень аккуратно прикоснитесь кончиком к кости. Не стоит сверлить кость полностью.

Получается самая чистая инъекция с наименьшей травматичностью. При прокалывании черепа иглой шприца во время инъекции клеток удалите костную пыль ватным тампоном, смоченным в PBS или физрастворе. Верните шприц в насос и опустите иглу прямо вниз к отверстию бора.

Чтобы подтвердить местоположение, аккуратно перемешайте клеточную суспензию и наберите клетки в шприц. Используя контроллер насоса, избегайте образования пузырей и комочков и протрите иглу спиртовым тампоном. Чтобы удалить загрязняющие клетки на наружной поверхности, опустите иглу до уровня поверхности черепа.

Затем медленно опустите иглу. Проткните всю толщину черепа и проникните в мозг на глубину до четырех миллиметров вентрально в течение одной минуты, прежде чем медленно извлечь иглу на 3,5 миллиметра вентрально, подтвердите, что правильные параметры введены в контроллер насоса и нажмите на прогон. Остановка. Чтобы произвести автоинъекцию клеток, следите за работой шприца и убедитесь, что поршень движется в бочке.

Оставьте иглу на месте на одну-две минуты, прежде чем очень медленно извлекать иглу из ткани. Иглу следует извлекать в течение пяти минут. С помощью ватного тампона промокните область вокруг отверстия и оставьте края кожи открытыми, чтобы кость высохла.

Извлеките шприц из насоса и быстро прокачайте его стерильной водой и этанолом. Затем нанесите стерильный костный воск на отверстие для бора и с помощью деревянного конца стерильного ватного тампона нанесите воск на кость и внутрь нее. Если поверхность достаточно высушена, она должна прилипнуть После наложения швов на рану уменьшите изофтор до 0% и снимите мышь со стереотаксической установки.

Поместите животное на нагретую поверхность и наблюдайте до полного восстановления. Важно очистить все инструменты и оборудование с использованием 70% этанола и стерилизатора для шариков или провести дезинфекцию между каждым животным. За инъекционными мышами следует наблюдать в течение двух дней после процедуры на предмет признаков боли, инфекции или других осложнений.

Оцените мышей на наличие клинических признаков паралича заболевания, снижения активности, потери веса, судорог или общего заболевания в желаемое время. Точки после инъекции контролируйте развитие опухоли с помощью магнитно-резонансной томографии или систем визуализации in vivo. Эти взвешенные изображения МРТ сравнивают опухоль, полученную из клеток U 87, с опухолью, полученной из клеток U2 51.

Объемы опухоли, построенные во времени, показывают воспроизводимое окно развития и роста опухоли, которое согласуется во всех экспериментах. Трансдуцированные клетки GBM, введенные внутричерепно обнаженным мышам, показывают, что мышь слева была успешно инъецирована, и показывает очень сильный вокализованный сигнал в нужном месте. В то время как мышь справа демонстрирует неудачный результат от неправильного расположения инъекции или техники.

Размер опухоли оценивается по активности люцифер в интересующей области мозга и строится на графике с течением времени. Синяя линия соответствует мыши с успешной внутричерепной инъекцией, в то время как красная линия соответствует мыши со смещением опухолевых клеток в позвоночник после h и e, окрашивание опухоли из клеток U 87 GBM показывает область плотного опухолевого роста и прилегающую нормальную ткань мозга с микроскопической инвазией злокачественных клеток. Этот участок центра опухоли, полученный из клеток U2 51 GBM, очень точно повторяет причудливую гистопатологию с многоядерными злокачественными клетками, наблюдаемую у типичного человека GBM.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что воспроизводимость модели опухоли зависит от точного и безопасного положения головы мыши и последовательной локализации места инъекции. Кроме того, важна постепенная скорость и постоянное давление впрыска. Этот метод позволяет исследователям в области нейроонкологии исследовать новые терапевтические стратегии для опухолей головного мозга человека, устраняя при этом некоторую вариабельность, которая усугубляется неточной локализацией инъекции клеток опухоли головного мозга.