Репортер основе анализа роста для систематического анализа белка деградации

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы систематически определять вариации скоростей деградации белка путем их сопоставления с кинетикой роста дрожжей в жидкой культуре. Это достигается за счет того, что сначала растущие клетки экспрессируют репортерный белок, состоящий из сигнала деградации, связанного с метаболическим маркером в течение ночи до стационарной фазы в подходящей селективной среде. Затем измеряется оптическая плотность клеток для определения кинетики роста клеток, а затем рассчитывается минимальное время удвоения клеток во время фазы логарифма на основе кинетики роста с помощью специальной программы.

В конечном счете, рассчитанное минимальное время удвоения может быть использовано для определения вариаций кинетики деградации белка. Основные преимущества этого метода перед существующими методами, такими как анализ деградации цикламата или пульсового погони, добавили: наш метод прост в настройке. Сбор и анализ данных просты, а дизайн эссе чрезвычайно модульный.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области деградации горшков, например, какие элементы необходимы для распознавания неправильно свернутого горшка системой убиквитина. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я хотел провести скрининг для идентификации белков, участвующих в удалении убиквитина из их подмножества. Поэтому я придумал простой способ сравнения нескольких образцов, чтобы подготовить клетки к анализу.

Начните с трансформации соответствующих атрофических дрожжевых клеток, таких как TRY 4, 67, с плазмидой, содержащей слияние Дерона U-3 и дополнительный метаболический маркер для отбора и поддержания плазмид. Для отбора и поддержания плазмид выращивают клетки на агаровых планшетах в подходящей синтетической определенной среде, в которой отсутствуют маркеры отбора аминокислот, переносят выжившие колонии в пластыри, переносят клетки из пластырей в жидкие среды и инкубируют в течение ночи при 30 градусах Цельсия до достижения стационарной фазы. Затем для 15 образцов или менее разбавьте 50 микролитров клеток из ночной культуры 150 микролитрами синтетической определенной среды на лунку.

В планшете с прозрачным дном 96 лунок используйте считыватель микропланшетов для определения значений наружного диаметра 600 образцов. Затем, рассчитав точный объем, необходимый для получения дрожжевых клеток в количестве, эквивалентном наружному диаметру 600 0,25, раскрутите клетки в течение одной минуты при 12000 G и комнатной температуре повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре соответствующей селективной среды для получения наружного диаметра 600 0,25 и перенесите 200 микролитров разведенного штамма в одну лунку нового 96-луночного планшета, когда он превышает 15 Образцы подлежат испытанию. Перенесите 10 микролитров выращенных за ночь стационарных клеток в одну лунку нового 96-луночного планшета, содержащего 190 микролитров соответствующей селективной среды для измерения кинетики роста трансформированных дрожжевых клеток в условиях селективности.

Затем установите многорежимный считыватель микропланшетов на температуру инкубации 30 градусов Цельсия OD 600 с интервалами измерения 15 минут и орбитальными и линейными циклами встряхивания по одной минуте каждые семь минут. Затем инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в считывателе микропланшетов в течение 12-24 часов. Когда клетки достигнут стационарной фазы, экспортируйте необработанные данные в файл электронной таблицы, чтобы определить кинетику роста дрожжей с помощью MDT Calc.

Убедитесь, что файл электронной таблицы, содержащий данные о росте, сохранен и закрыт. Затем откройте прикладную программу MDT Calc по пути к файлу. Нажмите на прямоугольник, чтобы найти файл электронной таблицы под именем листа.

Введите имя электронной таблицы, в которой находятся необработанные данные в начальной позиции. Введите координаты времени в электронной таблице, ноль первого образца в столбце времени. Введите букву, определяющую местоположение столбца временных точек в секундах в пустом столбце, введите букву, определяющую местоположение пустого столбца.

Например, лунка А из 96 луночной пластины. Следующий. В поле Значение наружного диаметра выберите минимальное преобразованное значение наружного диаметра 600, необходимое для начала расчета УДТ. Обычно от 0,15 до 0,25, чтобы гарантировать, что MDT рассчитывается только для образцов, которые достигают определенного значения D 600 или выше.

После ввода последнего значения нажмите кнопку «Рассчитать» и убедитесь, что индикатор выполнения справа постепенно меняется на зеленый. Наконец, экспортируйте два набора данных, которые автоматически появятся на экране после завершения расчета MDT, в новую электронную таблицу. Убедитесь, что данные включают значение MDT для каждой скважины, которая проходит тест на минимальное значение OD, и время начала интервала, из которого был рассчитан MDT в этом репрезентативном эксперименте.

Относительные различия в кинетике деградации белка между диким типом и различными мутантными штаммами сравнивали: первоначально дикий тип U BBC шесть, дельта UBC семь дельта или DOA 10 дельта-клетки, экспрессирующие D, один VMAU три были выращены на синтетической определенной полной среде. Затем, чтобы измерить жабры, клетки промывали и инкубировали в синтетических определенных средах. За вычетом урацила аналогичные кривые роста и расчетный MDT наблюдались для всех штаммов, выращенных в синтетической определенной полной среде, исключая возможность того, что делеция любого из исследованных генов влияет на рост клеток.

Напротив, инкубация в синтетических определенных средах за вычетом урацила привела к плохому росту клеток дикого типа, в то время как у мутантных штаммов наблюдался лишь незначительный дефект роста. UBC 7 абсолютно необходим для деградации DEG One VMAU 3, что позволяет точно оценить даже частичные эффекты различных мутантов E two. Соответственно, быстрая кинетика роста наблюдается в клетках, экспрессирующих UBC семь с мутантами активного центра, C 89 s и N 81 A.In кроме того, было обнаружено, что два мутанта, которые, как предполагается, косвенно препятствуют деградации DEG one VMA ETH three V 20 5G и H 90 4K, также было обнаружено, что они усиливают рост клеток по сравнению с диким типом UBC 7. Хотя и в меньшей степени, чем у мутантов активного центра.

Таким образом, метод жабр может быть использован для точного измерения относительного вклада различных факторов деградации в стабильность репортерной подложки. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что протокол чувствителен к небольшим различиям в скорости деградации белка. Это преимущество, но это также означает, что следует проявлять осторожность при проектировании и проверке Deron, который будет использоваться после этой процедуры.

Другие методы, такие как высокопроизводительная флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова склонность к агрегации репортерных белков. По этой причине хорошей идеей будет также включить тег GFP в репортера. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как систематически определять изменения скорости деградации белка с помощью считывателя MICROPLATE и нашего специального программного обеспечения.