Методы клеточной прилагается измерения емкости в мышь надпочечников хромаффинных Cell

Общей целью этой процедуры является обнаружение одиночных пузырьков, цитоза и эндоцитоза. Это достигается путем получения сначала чистого и полного переваривания ткани надпочечников мыши. Вторым этапом является диссоциация и пластинчатая клетка надпочечников.

Затем хроминовые клетки идентифицируются и зажимаются патчами для получения записей емкости, присоединенной к ячейке. В конечном итоге могут наблюдаться одиночные везикулы, цитоз и эндоцитоз. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как запись одиночных ионных каналов, заключается в том, что мы можем обнаруживать экзоцитоз и эндоцитоз одиночных везикул.

Наглядная демонстрация этого метода полезна, так как получение гига-печати сложно освоить. Кроме того, может быть трудно идентифицировать клетки среди смешанных типов клеток, обнаруженных в пластине. Подготовка к операции начинается с автоклавирования пары большого и малого диссекционирования, ножниц и двух пар щипцов.

Затем поставьте лоток для препарирования на ведро со льдом. Также начинают пузырчать ферментный раствор с 5% углекислого газа и 95% кислорода. Раствор имеет ярко-розовый цвет перед барботированием. Следующий.

После усыпления и обезглавливания новорожденной или трехдневной мыши, используйте меньший набор ножниц, чтобы разрезать спину щенка, следуя позвоночнику от шейного отдела до области позвоночника. Обязательно делайте надрез поверхностно под кожей, чтобы избежать прокалывания полости тела. Затем снимите кожу с позвоночника так, чтобы мускулатура была обнажена и был четкий обзор позвоночного столба.

Теперь сделайте поперечный разрез в шейном отделе спинного мозга, а затем сделайте два параллельных разреза по бокам позвоночника одной парой щипцов, удерживающих основное тело животного. Используйте другую пару щипцов, чтобы захватить позвоночник и отклеить позвоночник до тех пор, пока почки не обнажаются. После того, как надпочечники будут расположены на вершине почек, используйте щипцы для их удаления.

Затем осторожно поместите надпочечники в коническую трубку, наполненную раствором замка. С помощью второй пары щипцов вытесните надпочечники. Если они прилипли к первой паре щипцов, поместите коническую трубку на лед.

Сальники можно держать в замковом растворе до двух часов. На этом этапе проверьте ферментный раствор, чтобы убедиться, что уравновешенный раствор превратился из ярко-розового цвета в розовато-оранжевый. Далее добавьте папе в только что пропузырившийся раствор фермента в конечной концентрации от 20 до 25 единиц на миллилитр.

Затем добавьте раствор пропанового фермента в новую коническую трубку и с помощью щипцов перенесите надпочечники в пропановую пробирку. Инкубируйте железы от 40 до 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте 75% раствора для инактивации в каждую пробирку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия еще 10 минут.

Через 10 минут аккуратно переложите железы в только что помеченную пробирку и трижды промойте железы питательной средой. После промывания поместите железы в 200 микролитров питательной среды, а затем аккуратно титруйте железы вверх и вниз через наконечник пипетки объемом 200 микролитров. При титровании поддерживайте железы на дне пробирки с усилием, направленным вниз от наконечника пипетки объемом 200 микролитров, и воздействуйте на ткань мягко и медленно Обязательно используйте медленные, непрерывные движения, никогда не пипетируя быстро или резко после титрования, добавьте еще 250 микролитров питательной среды, чтобы довести общий объем питательной среды до 450 микролитров.

Далее семь 12-миллиметровых крышек с предварительно покрытым покрытием PDL помещаются в тарелку для культур размером 60 на 50 миллиметров. Затем нанесите 60 микролитров клетки, содержащей раствор, на каждую из семи защитных стекол. После того, как блюдо будет готово, поместите его в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут.

После инкубации аккуратно добавьте пять миллилитров предварительно подогретых питательных сред в чашку для культивирования, затем инкубируйте в течение 24 часов перед выполнением записей, прикрепленных к клетке. После места инкубации 12-миллиметровая крышка, содержащая клетки надпочечников, проскальзывает во внеклеточный раствор. Поскольку были задействованы целые надпочечники, следующим шагом является дифференцировка между хроминовыми клетками и корковыми клетками.

В культуре хроминовые клетки, как правило, очень яркие, с коричневато-бежевой окраской и почти идеальной круглой формой. Напротив, корковые клетки меньше и тусклее, чем клетки CHRO. После вытягивания патч-пипеток, как описано в текстовом протоколе, окуните наконечник пипетки в расплавленный воск, чтобы уменьшить емкость стекла.

Затем отполируйте наконечник огневым огнем, чтобы сдуть этот воск изнутри наконечника пипетки. Затем соберите пипетку с раствором патч-пипетки так, чтобы ее сопротивление составляло примерно два мегаома. Приложите патч-пипетку к ее манипулятору и подведите ее в пределах нескольких микрон от клетки.

Продолжайте продвигаться вперед по пипетке, обращая внимание на малейшую деформацию клетки. Как только деформация будет обнаружена, применяйте мягкое всасывание до тех пор, пока не будет достигнуто уплотнение giga om. Получение конфигурации с подключением к ячейке.

После того, как будет обнаружено уплотнение гига-ома, сделайте записи, подключенные к ячейке, используя усилитель EPC с семью плюсами патч-зажимами и двухфазный аналоговый усилитель с блокировкой, как описано в текстовом протоколе, установите фазу синхронного усилителя таким образом, чтобы переходная емкость изменялась, вызываемая мягким всасыванием. Импульсы появляются только в емкости патча, или Im trace без проекции в патч, проводимость или повторная трассировка процесса патчинга служит механической стимуляцией. Поскольку ток действия обычно может быть зарегистрирован от большинства ячеек, определите типичные изменения емкости с отмеченным шагом в сторону уменьшения.

Последним шагом является сохранение данных для будущего анализа. Здесь показана типичная запись емкости, подключенной к ячейке, с несколькими нисходящими шагами. Каждый шаг вниз связан с одним эндоцитозом iCal.

После мастеринга клеточная культура может быть завершена в течение двух-трех часов, а запись может быть выполнена в течение следующих четырех дней после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области синаптической передачи к изучению переработки синаптических везикул в нейроэндокринных хроминовых клетках.