Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы количественно оценить относительные изменения уровня белка в центросомах при различных условиях. Например, в определенный момент клеточного цикла после ингибирования протеасомы это достигается путем предварительной обработки клеток, которые растут на покровных листках, либо ингибитором протеасом MG one 15, либо контрольным растворителем ДМСО. Затем сразу же добавляем BRDU к обеим клеткам и инкубируем их в течение четырех часов в инкубаторе для клеточных культур.

Вторым этапом является перенос крышечных накладных на 24-луночную пластину для фиксации ячеек. Затем клетки окрашивают антителами против BRDU и представляющих интерес белков, а затем соответствующими вторичными антителами. Заключительным этапом является получение изображений BRDU-положительных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения для цифровой визуализации, чтобы применить идентичное время экспозиции и длину оси Z к клеткам из каждого образца.

Затем анализ изображений для количественной оценки относительного уровня ромального VDA C3. В конечном счете, количественная иммунофлуоресцентная микроскопия используется для того, чтобы показать, что Centro сомальный пул VDA C3 увеличивается в два раза при ингибировании протеасомы во время S-фазы. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как проточная цитометрия, иммуноблоттинг или количественный микроскоп, заключается в том, что этот метод анализирует относительный ромальный уровень белка в двух по-разному обработанных образцах, которые обрабатываются на двух разных покровных листах. Этот метод использует нормализацию до внутреннего стандарта для контроля необходимости обработки двух экспериментальных клеточных популяций.

Кроме того, этот метод может дать представление о регуляции специфических белков в центросомах. Он также может быть применен в других ситуациях, таких как другие субклеточные структуры или исследование конкретных пулов белков, которые находятся в нескольких местах внутри клетки. Демонстрировать процедуру будет шу маджумдер, постдок из своей лаборатории. Для начала эксперимента необходимо пройти два раза по 10 на пятую асинхронно выращивать РПЭ по одной клетке в заранее подготовленные 35 миллиметровые чашки с покровными губами и выращивать клетки в двух миллилитрах готовой среды.

Заменяйте питательную среду каждые 24 часа свежей предварительно подогретой средой через 44 часа. Замените питательную среду полной средой, содержащей 0,05% ДМСО или MG 115 в конечной концентрации пять микромоляров, и одновременно добавьте BRDU в клетки в конечной концентрации 40 микромоляров для инкубации клеток в течение четырех часов. Затем перенесите каждую крышку на 24-луночную пластину.

Добавьте по 500 микролитров предварительно обработанного метанола в каждую лунку и инкубируйте пластину при температуре минус 20 градусов Цельсия, чтобы зафиксировать клетки. Через 10 минут сразу же трижды постирайте чехол с 500 микролитрами буфера для стирки. Инкубируйте неподвижные клетки на крышке, вставляйте 200 микролитров блокирующего буфера на 30 минут, пока клетки инкубируются.

Подготовьте увлажненную камеру, положив влажное бумажное полотенце в нижнюю половину пустой коробки для наконечников для пипеток объемом 1000 микролитров. Положите полоску отдушки на поверхность решетки и добавьте на параформу каплю 20 микролитров антитела кролика против V DDA three и мышиного антитела против гамма-тубулина, разведенного в блокирующем буфере. После блокировки на каждую каплю раствора антитела наденьте защитный листок.

Убедитесь, что ячейки погружены в воду, и закройте крышку коробки для наконечников. Инкубируйте клетки с первичными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия во увлажненной камере. Снова переверните крышки и верните их на 24.

Хорошо постирайте покровные листы, затем инкубируйте их в 150 микролитровом растворе вторичных антител, разведенных в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре. Зафиксируйте окрашенные РПЭ в одной ячейке 500 микролитрами метанола, охлажденного до минус 20 градусов Цельсия. После того как ячейки затвердеют в течение 10 минут, промойте их три раза в буфере для промывки.

Далее инкубируйте клетки в 200 микролитрах двух нормальных HCL в течение 30 минут. При комнатной температуре нейтрализуйте клетки 300 микролитрами одного моляра трис CL pH 8, и промойте клетки три раза. С помощью промывочного буфера заблокируйте ячейки 200 микролитрами блокирующего буфера на 30 минут при комнатной температуре.

После блокирования инкубируйте клетки с антителами к BRDU и блокирующим буфером в течение 45 минут при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненной камере. Верните крышку обратно на 24. Хорошо посудите и вымойте клетки.

Далее инкубируйте их со вторичными антителами, разведенными в 150 микролитрах блокирующего буфера. В 24 лунки блюдо в течение одного часа при комнатной температуре. Затем промойте крышечные стекла трижды одним пятном XPBS, каплей объемом шесть микролитров монтажного раствора, содержащего реагент Antifa, на стеклянном микроскопе.

Сдвиньте перевернутую защитную крышку стороной элемента вниз на монтажное решение. Мягкой чистящей салфеткой аккуратно прижмите защитное стекло к предметному стеклу, чтобы удалить лишнюю жидкость, запечатайте крышку на микроскопе. Скользите, нанося лак для ногтей по краю покровной планки.

Используйте 100-кратный масляный иммерсионный объектив APO с числовой апертурой 1,4 для получения изображений BRDU положительного RPE в одной ячейке при комнатной температуре. Определите подходящую верхнюю и нижнюю фокальную плоскость по оси Z с шагом 0,2 микрона и получите изображения вдоль оси Z. Затем выполните деконволюцию всех стеков изображений, полученных по оси Z.

Получите общую интенсивность проекции каждого изображения. Укладывайте вдоль оси Z для клеток, центросомы которых разделены менее чем на два микрона. Нарисуйте небольшой квадрат от 20 до 30 пикселей со стороны вокруг обеих центросом и отметьте выбранную область.

Нарисуйте квадрат большего размера, от 24 до 35 пикселей со стороной, вокруг первого квадрата и отметьте выбранную область большого квадрата. Затем получите площадь и общую интенсивность флуоресценции каждой флюоресцентной четверки. В каждом поле рассчитайте скорректированную на фон интенсивность флуоресценции каждого флюороса. Четыре.

Наконец, получить нормированную интенсивность флуоресценции VDA C3 путем вычисления отношения скорректированной на фон интенсивности флуоресценции его флуоресценции. Четыре из четырех флюорограмм, использованных для выбранных внутренних стандартных изображений, были захвачены случайными полями асинхронно растущих клеток RPE One, инкубированных с BRDU и либо ингибитором протеасом MG one 15, либо контрольным растворителем DMSO и дисплеем ДНК и BRDU. На фоне скорректирована интенсивность флуоресценции, соответствующая Центральному Сомали.

VD 3 был примерно в 2,5 раза выше в MG 15 обработанных клетках, чем в контрольных клетках, как показано на этой диаграмме коробки и усов. Когда данные были нормализованы для общей флуоресценции VD на три по отношению к флуоресценции гамма-тубулина, кратность увеличилась, немного снизившись примерно до двух раз. Окрашивание VD C3 в неромальных цитах или на общий клеточный уровень VD 3 не влияло ингибированием протеасом.

Таким образом, ромальный пул VDA C3 регулируется за счет протеасомной опосредованной деградации. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что антитела против тестируемого белка и внутреннего стандарта должны быть повышены у разных видов хозяев, и что изображения обоих образцов должны быть получены с использованием идентичных параметров визуализации, таких как количество кесаревых сечений и время воздействия, чтобы свести к минимуму эффект цифровой визуализации.