Количественный иммунофлюоресценции для измерения различий в уровне белка на центросомах

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы количественно оценить относительные изменения уровня белка в центросомах при различных условиях. Например, в определенный момент клеточного цикла после ингибирования протеасомы это достигается путем предварительной обработки клеток, которые растут на покровных листках, либо ингибитором протеасом MG one 15, либо контрольным растворителем ДМСО. Затем сразу же добавляем BRDU к обеим клеткам и инкубируем их в течение четырех часов в инкубаторе для клеточных культур.

Вторым этапом является перенос крышечных накладных на 24-луночную пластину для фиксации ячеек. Затем клетки окрашивают антителами против BRDU и представляющих интерес белков, а затем соответствующими вторичными антителами. Заключительным этапом является получение изображений BRDU-положительных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа и программного обеспечения для цифровой визуализации, чтобы применить идентичное время экспозиции и длину оси Z к клеткам из каждого образца.